引用本文: 徐恬, 張昀哲, 雷學忠. 高乙型肝炎病毒前基因組RNA的乙型肝炎病毒感染者臨床特征分析. 華西醫學, 2024, 39(8): 1184-1187. doi: 10.7507/1002-0179.202305083 復制
版權信息: ?四川大學華西醫院華西期刊社《華西醫學》版權所有,未經授權不得轉載、改編
乙型病毒性肝炎(乙肝)目前仍是世界性的公共衛生難題,全球有超過 2.5 億人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV),每年有超過 78 萬人死于乙肝[1]。肝癌是全球癌癥相關死亡的第二大原因[2],而約有 40%的肝細胞癌來源于未得到控制的慢性乙肝(chronic hepatitis B, CHB),我國的這一比例更高,達 70%以上[3]。CHB 患者的全程管理對于減少乙肝相關不良事件的發生非常重要,包括對疾病活動性的長期監測、在合適的時期選擇合適的抗病毒治療方案、治療效果的評估、預后預測及預防管理。目前,臨床上主要基于 HBV 感染患者血清中幾種生物標志物的水平,包括丙氨酸轉氨酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate transaminase, AST)、HBV 表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg)和病毒 DNA 等,進行疾病分期和臨床管理[4]。肝內 HBV 共價閉合環狀 DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)水平是目前被認為反映病毒活躍程度及抗病毒治療反應最直接的指標[5]。目前血清學檢查無法直接檢測 HBV cccDNA,其檢查依賴于有創性的肝臟活檢,因此,有必要開發無創的替代標志物來監測 ccc DNA 的數量或活性[6]。HBV 前基因組 RNA(pregenomic RNA, pgRNA)是 HBV 復制的中間產物,理論上 HBV pgRNA 的唯一來源為肝內 cccDNA,因此 pgRNA 有望成為替代 cccDNA 的血清學標志物。已有研究表明相比其他血清學標志物,血清 HBV DNA 聯合 pg RNA 在核苷類似物(nucleotide analogue, NA)治療前和治療期間,與肝內 cccDNA 的相關性更好[7]。臨床上通常將功能性治愈作為 CHB 治療的目標,我國目前治療 CHB 的主要藥物為 NA 及干擾素[8]。而 NA 往往是患者開始抗病毒治療的第一步,治療方案的選擇及治療過程中的藥效評估均需要更優的血清學標志物提供依據。pgRNA 作為一種新的血清學標志物,有必要進一步研究其在臨床實踐中的價值。本研究試圖通過分析高 HBV pgRNA 人群的臨床特征,進一步探索 pgRNA 在 CHB 患者管理中的價值。
1 對象與方法
1.1 研究對象
納入 2020 年 12 月 1 日-2022 年 4 月 1 日于四川大學華西醫院感染性疾病中心肝炎門診治療隨訪的長期使用 NA 治療的 CHB 患者。納入標準:① 根據《慢性乙型肝炎防治指南(2019 年版)》[9]確診的 CHB 患者;② 接受目前常用的 NA 即恩替卡韋、富馬酸丙酚替諾福韋或富馬酸替諾福韋酯治療 1 年以上。排除標準:① 年齡<18 歲;② 肝硬化和惡性腫瘤患者;③ 存在免疫缺陷的患者;④ 資料不全的患者。本研究由四川大學華西醫院生物醫學倫理分委會批準,批件號為 2016 年審(91)號,并獲得了所有患者的知情同意。
1.2 研究方法
1.2.1 一般資料收集
收集入組患者的基本信息,包括性別和年齡。
1.2.2 血液指標采集和檢測
① 實驗室指標:本研究中所有患者的血樣采集集中在 2022 年 1 月1日-2022年4月1日,檢測的指標主要包括反映肝臟本身炎癥程度的指標,包括 ALT、AST、γ-谷氨酰轉移酶(γ-glutamyl transferase, GGT)和甲胎蛋白,以及反映 HBV 感染的標志物,包括 HBsAg、HBV e 抗原(HBV e antigen, HBeAg)和 HBV DNA,所有實驗室檢測項目均在四川大學華西醫院檢驗科進行。
② HBV pgRNA:本研究使用 HBV 核酸測定試劑盒(上海仁度生物科技股份有限公司)測定 pgRNA。檢測方法包括核酸捕獲及實時熒光核酸等溫擴增檢測。將 250 μL 的待測血清樣本與病毒核酸提取液混合后,在 60℃下孵育 10 min,隨后進行室溫冷卻以促進 RNA 捕獲探針與靶標 RNA 的結合。通過磁性顆粒捕獲靶標 RNA 并使用洗滌液清洗 2 次,最后將純凈的 RNA 復合物加入擴增檢測液中。擴增檢測液體系由擴增檢測液 1、擴增檢測液 2 和酶液組成,擴增反應在 42℃下進行 40 min。反應體系中使用了實時熒光核酸等溫擴增檢測技術,通過熒光探針實時檢測 RNA 產物的擴增情況。熒光信號的強度與樣本中靶標 RNA 的濃度成比例,最終由檢測儀器實時采集熒光信號并進行定量分析。每個檢測反應都包含內標以監控樣本處理的質量。系統通過校準曲線自動確定樣本中的 HBV RNA 濃度,報告的單位為拷貝數/mL。按照 HBV 核酸測定試劑盒說明書中介紹的使用方法,根據檢測結果進行數據分析,并結合臨床表現進行綜合判斷。根據 pgRNA 的檢測下限值,將 HBV pgRNA≥15 拷貝數/mL 的患者歸為高 pgRNA 組,pgRNA 低于檢測下限(即<15 拷貝數/mL)歸為低 pgRNA 組。為了進一步探究 pgRNA 在預測CHB安全停藥中的應用價值,鑒于有研究顯示 HBsAg<100 U/mL 時停藥風險較低[10],故統計了兩組中 HBsAg<100 U/mL 的患者數量。
1.3 統計學方法
使用 SPSS 27.0 軟件進行統計分析。計數資料以頻數和/或百分比表示,組間比較采用 χ2 檢驗。所有計量資料均不符合正態分布,以中位數(下四分位數,上四分位數)描述,組間比較采用 Mann-Whitney U 檢驗。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 入組患者的整體情況
排除了有長期激素服用史的患者 9 例,患有肝細胞癌的患者 7 例,臨床資料不完整的患者 1 例后,本次研究共納入了 107 例患者。男性患者占比 66.4%(71/107),平均年齡為 44.02 歲。HBeAg 陽性患者占 76.6%(82/107)。16.8%(18/107)的患者存在 ALT 升高(≥50 U/L),11.2%(12/107)的患者存在 AST 升高(≥40 U/L),HBV DNA 高于檢測值上限(5 U/mL)的患者占 62.6%(67/107)。高 pgRNA 組和低 pgRNA 組分別有 45 例(42.1%)和 62 例(57.9%)患者。
2.2 高 pgRNA 組與低 pgRNA 組 CHB 患者的臨床特征比較
高 pgRNA 組與低 pgRNA 組的性別、年齡、AST、ALT、GGT、HBsAg、HBeAg≥0.1 U/mL 的患者比例、HBV DNA、甲胎蛋白差異均無統計學意義(P>0.05)。高 pgRNA 組 HBsAg<100 U/mL 的患者比例低于低 pgRNA 組(P<0.05)。見表1。

3 討論
目前,CHB 的治療目標傾向于臨床治愈[11],但由于 HBV cccDNA 作為持久性的病毒儲存庫持續存在于受感染的肝細胞內[12],導致部分已經實現臨床治愈的患者停藥后出現病毒學復發[13],導致 CHB 完全治愈成為遙不可及的治療目標。因此,根除 cccDNA 對實現 CHB 治愈具有十分重要的意義。目前有很多治愈類藥物研究都以 cccDNA 作為直接或間接的靶點[14],為了更加經濟、無創地評估體內 cccDNA 活動性和/或水平,以更加方便的血清學標志物檢測替代肝臟活檢必然也是未來探索的方向。
由于肝臟穿刺的有創性,臨床醫生判斷 CHB 患者體內的病毒活躍程度及肝臟炎癥反應主要依賴于傳統的病毒學指標及血液肝臟相關生化指標[15]。HBV pgRNA 這一新的指標越來越受到關注,它通常被視為具有反映 HBV cccDNA 復制活性、指導停藥時間或評估 NA 治療預后潛力的血清學指標[16]。針對 pgRNA 預測價值的研究也日益增多。有研究表明,HBV pgRNA 可用于區分治療前慢性感染期和慢性肝炎期,尤其是在 HBeAg 陰性患者中,有助于判斷某些患者是否需要早期積極抗病毒治療[17]。也有研究發現血清 HBV pgRNA 水平與進展為肝硬化和肝細胞癌的風險具有正相關關系[18]。
本研究顯示,高 pgRNA 組與低 pgRNA 組的 HBsAg 水平差異無統計學意義,可能是由于樣本量較小而導致檢驗效能不足,也可能提示 HBsAg 的產生主要歸因于患者體內的整合 HBV DNA 而不是 cccDNA[19]。目前臨床上常用的治療方案包括 NA 和聚乙二醇干擾素,臨床治愈往往需要兩者聯合用藥[20],并且有研究表明,基線 HBsAg<1 500 U/mL 的患者中,NA 聯合聚乙二醇干擾素具有更高的 HBsAg 清除率[21]。由于干擾素價格昂貴,且具有相較于 NA 更多的藥物副作用,因此要求臨床醫生對聯合治療方案優勢人群的判斷更加精確。理論上,pgRNA 可以反映出體內 cccDNA 作為病毒儲存庫而產生的 HBsAg[22],這將不受到體內本身存在的不斷循環的 HBsAg 的影響,因此將 pgRNA 和 cccDNA 聯合使用以發現優勢人群或許可以提高聯合治療的成功率。由于表面抗原在感染者中充當抑制性免疫環境中的重要角色[23],pgRNA 在評估 CHB 免疫治療療效中的應用價值值得進一步探索。除此之外,本研究以 100 U/mL 作為臨界進行分析后,發現高 pgRNA 組患者的 HBsAg≥100 U/mL的比例更高。有研究發現 NA 鞏固治療 3 年以上且 HBsAg<100 U/mL 的情況下,停藥后或可產生持續的病毒學應答[10]。因此,pgRNA 低于檢測下限或許提示 NA 停藥后復發風險降低。
綜上,本研究顯示,高 pgRNA 患者 HBsAg≥100 U/mL 的比例更高。本研究通過收集高 pgRNA 患者的臨床資料并進行整理分析,以期望總結高 HBV pgRNA 人群的臨床特征。因目前臨床上 HBV pgRNA 檢測的開展相對有限,本研究可能對將來 pgRNA 作為新的血清學標志物的研究方向具有一定的意義。然而,本研究缺乏患者治療前的相關數據,無法在治療前后進行比較。并且未對患者是否發生肝臟相關不良事件進行隨訪。因此,仍需進一步延長隨訪時間和擴大樣本量,幫助進行進一步的研究。
作者貢獻:徐恬、張昀哲負責論文撰寫和修改;雷學忠負責論文選題和指導撰寫文章并最后定稿。
利益沖突:所有作者聲明不存在利益沖突。
乙型病毒性肝炎(乙肝)目前仍是世界性的公共衛生難題,全球有超過 2.5 億人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV),每年有超過 78 萬人死于乙肝[1]。肝癌是全球癌癥相關死亡的第二大原因[2],而約有 40%的肝細胞癌來源于未得到控制的慢性乙肝(chronic hepatitis B, CHB),我國的這一比例更高,達 70%以上[3]。CHB 患者的全程管理對于減少乙肝相關不良事件的發生非常重要,包括對疾病活動性的長期監測、在合適的時期選擇合適的抗病毒治療方案、治療效果的評估、預后預測及預防管理。目前,臨床上主要基于 HBV 感染患者血清中幾種生物標志物的水平,包括丙氨酸轉氨酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate transaminase, AST)、HBV 表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg)和病毒 DNA 等,進行疾病分期和臨床管理[4]。肝內 HBV 共價閉合環狀 DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)水平是目前被認為反映病毒活躍程度及抗病毒治療反應最直接的指標[5]。目前血清學檢查無法直接檢測 HBV cccDNA,其檢查依賴于有創性的肝臟活檢,因此,有必要開發無創的替代標志物來監測 ccc DNA 的數量或活性[6]。HBV 前基因組 RNA(pregenomic RNA, pgRNA)是 HBV 復制的中間產物,理論上 HBV pgRNA 的唯一來源為肝內 cccDNA,因此 pgRNA 有望成為替代 cccDNA 的血清學標志物。已有研究表明相比其他血清學標志物,血清 HBV DNA 聯合 pg RNA 在核苷類似物(nucleotide analogue, NA)治療前和治療期間,與肝內 cccDNA 的相關性更好[7]。臨床上通常將功能性治愈作為 CHB 治療的目標,我國目前治療 CHB 的主要藥物為 NA 及干擾素[8]。而 NA 往往是患者開始抗病毒治療的第一步,治療方案的選擇及治療過程中的藥效評估均需要更優的血清學標志物提供依據。pgRNA 作為一種新的血清學標志物,有必要進一步研究其在臨床實踐中的價值。本研究試圖通過分析高 HBV pgRNA 人群的臨床特征,進一步探索 pgRNA 在 CHB 患者管理中的價值。
1 對象與方法
1.1 研究對象
納入 2020 年 12 月 1 日-2022 年 4 月 1 日于四川大學華西醫院感染性疾病中心肝炎門診治療隨訪的長期使用 NA 治療的 CHB 患者。納入標準:① 根據《慢性乙型肝炎防治指南(2019 年版)》[9]確診的 CHB 患者;② 接受目前常用的 NA 即恩替卡韋、富馬酸丙酚替諾福韋或富馬酸替諾福韋酯治療 1 年以上。排除標準:① 年齡<18 歲;② 肝硬化和惡性腫瘤患者;③ 存在免疫缺陷的患者;④ 資料不全的患者。本研究由四川大學華西醫院生物醫學倫理分委會批準,批件號為 2016 年審(91)號,并獲得了所有患者的知情同意。
1.2 研究方法
1.2.1 一般資料收集
收集入組患者的基本信息,包括性別和年齡。
1.2.2 血液指標采集和檢測
① 實驗室指標:本研究中所有患者的血樣采集集中在 2022 年 1 月1日-2022年4月1日,檢測的指標主要包括反映肝臟本身炎癥程度的指標,包括 ALT、AST、γ-谷氨酰轉移酶(γ-glutamyl transferase, GGT)和甲胎蛋白,以及反映 HBV 感染的標志物,包括 HBsAg、HBV e 抗原(HBV e antigen, HBeAg)和 HBV DNA,所有實驗室檢測項目均在四川大學華西醫院檢驗科進行。
② HBV pgRNA:本研究使用 HBV 核酸測定試劑盒(上海仁度生物科技股份有限公司)測定 pgRNA。檢測方法包括核酸捕獲及實時熒光核酸等溫擴增檢測。將 250 μL 的待測血清樣本與病毒核酸提取液混合后,在 60℃下孵育 10 min,隨后進行室溫冷卻以促進 RNA 捕獲探針與靶標 RNA 的結合。通過磁性顆粒捕獲靶標 RNA 并使用洗滌液清洗 2 次,最后將純凈的 RNA 復合物加入擴增檢測液中。擴增檢測液體系由擴增檢測液 1、擴增檢測液 2 和酶液組成,擴增反應在 42℃下進行 40 min。反應體系中使用了實時熒光核酸等溫擴增檢測技術,通過熒光探針實時檢測 RNA 產物的擴增情況。熒光信號的強度與樣本中靶標 RNA 的濃度成比例,最終由檢測儀器實時采集熒光信號并進行定量分析。每個檢測反應都包含內標以監控樣本處理的質量。系統通過校準曲線自動確定樣本中的 HBV RNA 濃度,報告的單位為拷貝數/mL。按照 HBV 核酸測定試劑盒說明書中介紹的使用方法,根據檢測結果進行數據分析,并結合臨床表現進行綜合判斷。根據 pgRNA 的檢測下限值,將 HBV pgRNA≥15 拷貝數/mL 的患者歸為高 pgRNA 組,pgRNA 低于檢測下限(即<15 拷貝數/mL)歸為低 pgRNA 組。為了進一步探究 pgRNA 在預測CHB安全停藥中的應用價值,鑒于有研究顯示 HBsAg<100 U/mL 時停藥風險較低[10],故統計了兩組中 HBsAg<100 U/mL 的患者數量。
1.3 統計學方法
使用 SPSS 27.0 軟件進行統計分析。計數資料以頻數和/或百分比表示,組間比較采用 χ2 檢驗。所有計量資料均不符合正態分布,以中位數(下四分位數,上四分位數)描述,組間比較采用 Mann-Whitney U 檢驗。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 入組患者的整體情況
排除了有長期激素服用史的患者 9 例,患有肝細胞癌的患者 7 例,臨床資料不完整的患者 1 例后,本次研究共納入了 107 例患者。男性患者占比 66.4%(71/107),平均年齡為 44.02 歲。HBeAg 陽性患者占 76.6%(82/107)。16.8%(18/107)的患者存在 ALT 升高(≥50 U/L),11.2%(12/107)的患者存在 AST 升高(≥40 U/L),HBV DNA 高于檢測值上限(5 U/mL)的患者占 62.6%(67/107)。高 pgRNA 組和低 pgRNA 組分別有 45 例(42.1%)和 62 例(57.9%)患者。
2.2 高 pgRNA 組與低 pgRNA 組 CHB 患者的臨床特征比較
高 pgRNA 組與低 pgRNA 組的性別、年齡、AST、ALT、GGT、HBsAg、HBeAg≥0.1 U/mL 的患者比例、HBV DNA、甲胎蛋白差異均無統計學意義(P>0.05)。高 pgRNA 組 HBsAg<100 U/mL 的患者比例低于低 pgRNA 組(P<0.05)。見表1。

3 討論
目前,CHB 的治療目標傾向于臨床治愈[11],但由于 HBV cccDNA 作為持久性的病毒儲存庫持續存在于受感染的肝細胞內[12],導致部分已經實現臨床治愈的患者停藥后出現病毒學復發[13],導致 CHB 完全治愈成為遙不可及的治療目標。因此,根除 cccDNA 對實現 CHB 治愈具有十分重要的意義。目前有很多治愈類藥物研究都以 cccDNA 作為直接或間接的靶點[14],為了更加經濟、無創地評估體內 cccDNA 活動性和/或水平,以更加方便的血清學標志物檢測替代肝臟活檢必然也是未來探索的方向。
由于肝臟穿刺的有創性,臨床醫生判斷 CHB 患者體內的病毒活躍程度及肝臟炎癥反應主要依賴于傳統的病毒學指標及血液肝臟相關生化指標[15]。HBV pgRNA 這一新的指標越來越受到關注,它通常被視為具有反映 HBV cccDNA 復制活性、指導停藥時間或評估 NA 治療預后潛力的血清學指標[16]。針對 pgRNA 預測價值的研究也日益增多。有研究表明,HBV pgRNA 可用于區分治療前慢性感染期和慢性肝炎期,尤其是在 HBeAg 陰性患者中,有助于判斷某些患者是否需要早期積極抗病毒治療[17]。也有研究發現血清 HBV pgRNA 水平與進展為肝硬化和肝細胞癌的風險具有正相關關系[18]。
本研究顯示,高 pgRNA 組與低 pgRNA 組的 HBsAg 水平差異無統計學意義,可能是由于樣本量較小而導致檢驗效能不足,也可能提示 HBsAg 的產生主要歸因于患者體內的整合 HBV DNA 而不是 cccDNA[19]。目前臨床上常用的治療方案包括 NA 和聚乙二醇干擾素,臨床治愈往往需要兩者聯合用藥[20],并且有研究表明,基線 HBsAg<1 500 U/mL 的患者中,NA 聯合聚乙二醇干擾素具有更高的 HBsAg 清除率[21]。由于干擾素價格昂貴,且具有相較于 NA 更多的藥物副作用,因此要求臨床醫生對聯合治療方案優勢人群的判斷更加精確。理論上,pgRNA 可以反映出體內 cccDNA 作為病毒儲存庫而產生的 HBsAg[22],這將不受到體內本身存在的不斷循環的 HBsAg 的影響,因此將 pgRNA 和 cccDNA 聯合使用以發現優勢人群或許可以提高聯合治療的成功率。由于表面抗原在感染者中充當抑制性免疫環境中的重要角色[23],pgRNA 在評估 CHB 免疫治療療效中的應用價值值得進一步探索。除此之外,本研究以 100 U/mL 作為臨界進行分析后,發現高 pgRNA 組患者的 HBsAg≥100 U/mL的比例更高。有研究發現 NA 鞏固治療 3 年以上且 HBsAg<100 U/mL 的情況下,停藥后或可產生持續的病毒學應答[10]。因此,pgRNA 低于檢測下限或許提示 NA 停藥后復發風險降低。
綜上,本研究顯示,高 pgRNA 患者 HBsAg≥100 U/mL 的比例更高。本研究通過收集高 pgRNA 患者的臨床資料并進行整理分析,以期望總結高 HBV pgRNA 人群的臨床特征。因目前臨床上 HBV pgRNA 檢測的開展相對有限,本研究可能對將來 pgRNA 作為新的血清學標志物的研究方向具有一定的意義。然而,本研究缺乏患者治療前的相關數據,無法在治療前后進行比較。并且未對患者是否發生肝臟相關不良事件進行隨訪。因此,仍需進一步延長隨訪時間和擴大樣本量,幫助進行進一步的研究。
作者貢獻:徐恬、張昀哲負責論文撰寫和修改;雷學忠負責論文選題和指導撰寫文章并最后定稿。
利益沖突:所有作者聲明不存在利益沖突。