引用本文： 王永康, 余瑋, 克力木·阿不都熱依木, 買買提·依斯熱依力. 醛脫氫酶 18 家族成員 A1 在食管癌細胞中結合的靶標及測序分析. 華西醫學, 2024, 39(8): 1188-1194. doi: 10.7507/1002-0179.202401287 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《華西醫學》版權所有，未經授權不得轉載、改編
目前，關于食管癌的發病模式和關鍵病因尚不清晰[1]。研究表明，當食管細胞的基因表達過程發生變化（突變）時，其有可能發展成食管癌。近年來，RNA 結合蛋白（RNA binding protein, RBP）因在揭示各類疾病機制方面的重要作用而被關注[2-3]。進而，其在腫瘤中的作用也逐漸被重視。RBP 能與雙鏈或單鏈 RNA 結合，在轉錄和轉錄后調控中發揮關鍵作用。RBP 可以影響 RNA 的整個生命周期，包括剪接、修飾、翻譯、細胞內定位和降解等。通過這種機制，RNA 結合蛋白在腫瘤的發展中發揮著重要作用[4]。RBP 在各種人類癌癥中失調，對腫瘤的發展和進展有潛在的作用[5]。
醛脫氫酶 18 家族成員 A1（aldehyde dehydrogenase 18 family member A1，ALDH18A1）作為一種 RNA 結合蛋白，其具有結合靶標基因的 RNA 來調控靶標基因一系列生物學過程的能力。在乳腺癌中 ALDH18A1 作為人表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor-2, HER2）特異性 RNA 結合蛋白，它與乳腺癌的侵襲性相關[6-7]。ALDH18A1 能夠調控轉錄因子表達并參與轉錄調控過程。在神經母細胞瘤的生長中，ALDH18A1 在轉錄和轉錄后都能調節原癌基因的表達，從而 ALDH18A1 能夠作為神經母細胞瘤細胞增殖、自我更新和引起腫瘤發生的調節劑[8]。同時，ALDH18A1 表達水平上調與肺癌的發生和發展密切相關[9]。而敲低 ALDH18A1 靶向脯氨酸生物合成能顯著抑制黑色素瘤細胞和異種腫瘤的生長[10]。因而可推測 ALDH18A1 可能通過與信使 RNA（messenger RNA, mRNA）結合，從而調控食管癌相關基因的表達過程。因此，本文通過 RNA 免疫共沉淀測序（RNA immunoprecipitation sequencing, RIP-seq）技術鑒定食管癌細胞（KYSE150）中 ALDH18A1 結合的 RNA，以探究 ALDH18A1 在 KYSE150 細胞中作用靶標、影響基因表達和食管癌相關的生物學過程，為進一步研究食管癌細胞中 ALDH18A1 相互作用的綜合調控提供依據。
1 材料與方法
1.1 主要材料與儀器
RPMI-1640 培養基（北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清、鏈霉素和青霉素（美國賽默飛世爾科技公司）；無菌 1%磷酸緩沖鹽溶液（北京索萊寶科技有限公司）；Lipofectamine 2000 轉染試劑（美國賽默飛世爾科技公司）；總 RNA 提取試劑（北京索萊寶科技有限公司）；微球菌核酸酶（美國賽默飛世爾科技公司）；RQⅠ無核糖核酸酶活性 DNA 酶［普洛麥格（北京）生物技術有限公司］；特異性多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；蛋白酶 K（上海羅氏制藥有限公司）；Trizol 試劑（美國賽默飛世爾科技公司）；多聚核苷酸激酶緩沖液（美國賽默飛世爾科技公司）；KAPA RNA HyperPrep 試劑盒（上海羅氏制藥有限公司）；低溫超速離心機［大龍興創實驗儀器（北京）股份公司］；水平離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；NovaSeq 6000 基因測序儀（美國因美納公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
選用 KYSE150 細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）在 37°C、5%二氧化碳條件下，培養于含 10%胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素和 100 U/mL 青霉素的 RPMI-
1.2.2 細胞裂解和 RNA 片段處理
KYSE150 細胞以 400 mJ/cm2 照射 1 次，并在冰洗緩沖液中裂解。細胞裂解在冷洗緩沖液［1 倍標準濃度×磷酸緩沖鹽溶液（0.01 mol/L 濃度），0.1%十二烷基硫酸鈉，0.5% 乙基苯基聚乙二醇和 0.5%脫氧膽酸鈉］中進行，并添加 200 U/mL RNA 酶（RNase）抑制劑和蛋白酶抑制劑雞尾酒，并在冰上孵育 30 min。在 4℃條件下，離心半徑 8.4 cm，
1.2.3 免疫共沉淀
將上清液的 1%用于 Input（陽性對照組，未免疫沉淀）樣本，將上清液加入 10 μL ALDH18A1 抗體進行免疫沉淀，使用免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）G抗體作為陰性對照，4℃孵育過夜。將免疫沉淀物與蛋白 A/G 磁珠在 4℃下孵育 2 h。移除上清液后，依次使用裂解液、高鹽緩沖液和多聚核苷酸激酶緩沖液洗滌 2 次。將懸液 70°C 孵育 20 min，釋放含有交聯 RNA 和免疫沉淀的 RBP。將細胞裂解液轉移到一個干凈的 1.5 mL 微孔管中。將蛋白酶 K 加入到 Input 組和免疫沉淀的 RBP 與交聯 RNA 中，最終濃度為 1.2 mg/mL。在 55°C 下孵育 120 min。用 Trizol 試劑純化 RNA。
1.2.4 RIP -seq 文庫制備和測序
基因文庫（cDNA 文庫）采用 KAPA RNA HyperPrep 試劑盒，為 RNA 進行高通量測序文庫構建，依照說明程序制備 cDNA 文庫。對于高通量測序，文庫按照說明制備，并應用于 Illumina NovaSeq 測序系統 150 堿基對（base pairs, bp）雙端測序。
1.2.5 分析數據
采用快速將測序數據進行快速剪接映射的程序（TopHat 2）將序列比對到參考基因組上，僅使用唯一映射的讀段進行后續分析。采用“ABLIRC”策略（用于峰值調用和分析測序數據集的工作流程）鑒定 ALDH18A1 在基因組上的結合區域。通過模體分析軟件軟件（HOMER）調用免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）蛋白的結合基序。并通過對 RNA 免疫共沉淀組（ALDH18A1 IP 組）和 Input 組分別進行模擬分析，并去除與 Input 組峰重疊的 ALDH18A1 IP 組峰。最終通過峰關聯分析 ALDH18A1 的靶基因。
1.2.6 數據篩選
在數據分析過程中，具有至少 1 bp 重疊的讀數被聚為峰。對每個基因，計算模擬生成的測序序列，其數量和長度與峰中的測序序列相同。輸出序列進一步映射到相同基因，以從重疊的序列中生成隨機的最大峰值高度。全過程重復 500 次。選取觀測到的峰高高于隨機最大值的峰（P<0.05）。
1.2.7 功能富集分析
為了篩選出峰相關基因（靶基因）的功能類別，使用基因功能富集平臺 KOBAS 2.0 對其京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析。采用超幾何檢驗和 Benjamini-Hochberg 方法控制錯誤發現率（false discovery rate, FDR）控制程序來定義各項的富集程度[11]。
1.3 統計學方法
運用 GraphPad Prism9.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用 t 檢驗。計數資料以頻數表示。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ALDH18A1 的 RNA 免疫共沉淀實驗
蛋白質免疫印跡實驗檢測免疫共沉淀效率見圖1。在 2 次重復實驗樣本中，目的蛋白被抗體較好富集，免疫共沉淀有效率，且樣本具有復現性。
圖1
蛋白質免疫印實驗檢測免疫共沉淀效率
Input：陽性對照；ALDH18A1 IP：醛脫氫酶 18 家族成員 A1 免疫共沉淀；IgG：免疫球蛋白G（陰性對照）；ALDH18A1：醛脫氫酶 18 家族成員 A1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶； Marker：標準蛋白分子量
2.2 高通量測序
通過對文庫行雙端 150 bp 測序，ALDH18A1 IP1、ALDH18A1 IP 2、 ALDH18A1 input 1 和 ALDH18A1 input 2 組得到的原始序列數分別為 54954362、51141638、50138652 和 53333480，而得到的有效序列數及其占原始序列數的比例分別為 49185406（89.50%）、45900183（89.75%）、42278596（84.32%）和 46763964（87.68%）。
同時，使用 TopHat2 軟件，比對到參考基因組的有效測序數據，結果顯示 ALDH18A1 IP1、ALDH18A1 IP2、ALDH18A1 input1 和 ALDH18A1 input2 組由測序得到的有效序列數能定位到基因組上的序列數及占比分別為 35372992（71.9 2%）、30357175（66.14%）、28459639（67.31%）和 31000823（66.29%），其中比對到有義鏈上的序列數占比為 89.77%、91.35%、77.82%和 84.08%，而比對到反義鏈上的序列數占比為 10.23%、8.65%、22.18%和 15.92%。
測序序列在基因組上的分布及占比見圖2。RNA 免疫共沉淀實驗質量控制較好，樣本具備復現性。測序序列在基因組各個分區情況結果顯示，相對于 input 組，ALDH18A1-IP 組的測序序列在編碼區、內含子和 5’非翻譯區區域明顯富集，內含子最顯著。
圖2
測序序列在基因組上的分布及占比
a. ALDH18A1 input 1 在不同區域的比例；b. ALDH18A1 input 2 在不同區域的比例；c. ALDH18A1 IP 1 在不同區域的比例；d. ALDH18A1 IP 2 在不同區域的比例；e. 全基因組的讀數分布條形圖。ALDH18A1：醛脫氫酶 18 家族成員 A1；Input：陽性對照；ALDH18A1 IP：醛脫氫酶 18 家族成員 A1 免疫共沉淀
2.3 結合峰分析
對 2 次重復實驗獲得的結合區域進行峰值識別，其結果顯示 2 次重復實驗獲得 8 258 個 ALDH18A1 結合區域（圖3a）。基序分析結果顯示，2 次重復實驗獲得的 ALDH18A1 的結合基序一致性較好，ALDH18A1 主要結合在 RNA 的 UGUAAUC 基序（圖3b）；且 UGUAAUC 基序也主要分布在內含子和編碼區（圖4）。
圖3
ALDH18A1 結合峰的情況
a. 維恩圖顯示 2 個實驗中得到的 ALDH18A1 結合峰的重疊情況；b. ALDH18A1 的前 5 個峰值首選結合基序。Rank：序列；Motif：基序
圖4
結合峰在基因組上的分布及占比
a.
2.4 結合峰相關基因 KEGG Pathway 富集分析
排名前 10 位的代謝通路的結合峰相關基因的功能 KEGG 分析見圖5。進一步對實驗中重復出現的 ALDH18A1 結合峰關聯的基因進行 KEGG 分析的結果表明，ALDH18A1 結合的 mRNA 分子主要參與了在對焦點黏附、癌癥的中心碳代謝、細胞周期、剪接體、RNA 運輸、泛素介導的蛋白水解等生物學過程高度富集（圖5）。
圖5
排名前 10 位的代謝通路的結合峰相關基因的功能 KEGG 分析
a. ALDH18A1 IP 1 結合峰相關的基因的 KEGG 分析；b. ALDH18A1 IP 2 結合峰相關的基因的 KEGG 聚類分析。代謝通路所對應的柱體越長說明該條目下基因數越多、富集后越顯著
3 討論
在哺乳動物體內，RNA 結合蛋白參與調控 mRNA 可變剪接，在腫瘤細胞內，可變剪接的功能紊亂是一種常見特性，其原因主要是 RBP 功能的改變[12]。RBP 也能夠調節腫瘤中轉錄本的多聚腺苷酸化和 mRNA 的穩定性。RBP 通過轉錄后調節靶 RNA 轉錄物的表達，在細胞生理學中發揮著關鍵作用。通過調節癌癥相關 mRNA 轉錄物的加工、穩定性和翻譯，大量 RBP 在各種類型的癌癥中發揮著重要作用[13-14]。RBP 活性的擾動與癌癥發展、腫瘤代謝、耐藥性、癌癥干細胞自我更新和腫瘤免疫逃避有因果關系。這種機制在建立和維持細胞極性上是非常關鍵的，而腫瘤細胞中該機制常常被改變[15]。在 mRNA 的翻譯過程中，RBP 對于誘導 mRNA 環化和翻譯激活是必不可少的，在癌癥中幾乎所有相關基因信號通路都會發生變化，這一過程與 RBP 調控 mRNA 的翻譯密不可分[16]。ALDH18A1 作為一種重要的 RNA 結合蛋白，在推動癌癥的發生發展過程中起著重要的作用。多項研究數據表明，ALDH18A1 與癌癥發生、發展和預后過程存在相關性[17-18]。鑒于以上基礎，本研究小組進行了一些研究以全面了解 ALDH18A1 在食道癌發生發展中的功能。
鑒于 RBP 在轉錄后調控中的關鍵作用，癌細胞可以合理地利用 RBP 功能障礙來調節各種癌癥相關轉錄本，從而獲得腫瘤發生優勢。在 mRNA 生命周期的每個階段，包括成熟（加帽、剪接和多聚腺苷酸化）、修飾、翻譯和衰變，與某些 RBP 的相互作用對細胞來說是極其動態和關鍵的，隨著越來越多的證據表明 RNA 經歷了許多修飾，這些修飾在正常和疾病發展中起著關鍵作用，RBP 的廣泛功能使它們在疾病發展過程中（尤其是癌癥）在 RBP-RNA 調節網絡中發揮著核心作用[19-20]。前體 mRNA 能夠通過可變剪接產生多種異構體，以執行相似或不同的生物學功能。可變剪接已被證明與許多疾病的發生有關，包括一些神經性疾病和腫瘤等，研究發現紫杉醇能夠促進上皮細胞轉化序列 2 發生可變剪接產生更短的剪接變體上皮細胞轉化序列 2-S，影響了 Wnt 通路和細胞增殖過程，從而抑制腫瘤進展[21]。可變剪接過程受到多種 RNA 結合蛋白的精密調控。然而，ALDH18A1 被發現作為一種潛在的 RBP，在 Hela 細胞中被發現 ALDH18A1 可作為 RNA 結合蛋白，并在某些情況下可調節其靶 mRNA 的表達從而影響不同的代謝途徑[22]。
在本研究中，相對于對照組，ALDH18A1-RNA 免疫共沉淀測序分析結果表明，ALDH 18A1 結合在編碼區、內含子和 5’非翻譯區的區域顯著富集；ALDH18A1 主要結合在 RNA 的 UGUAAUC 基序；結果表明 ALDH18A1 可能具有調控 mRNA 可變剪接功能。RIP-seq 數據綜合 KEGG 分析顯示，ALDH18A1 結合的 mRNA 分子參與了多種重要途徑，包括在對焦點黏附、癌癥的中心碳代謝、細胞周期、剪接體、RNA 運輸和泛素介導的蛋白水解等生物學過程高度富集。因此，ALDH18A1 可能影響食管癌相關的生物學過程。本研究對于 ALDH18A1 的功能，及其在食管癌細胞中的作用提供了新的數據支持和研究方向。
總的來說，RIP-seq 方法可確定被 RNA 結合蛋白結合的完整的 RNA 生物分子。在此，本研究從 RIP-seq 結果中確定了 ALDH18A1 蛋白的結合峰和基序，分析了結合峰相關基因相關的生物學過程。因此，可推測 ALDH18A1 可調節 KYSE150 細胞的選擇性剪接。這些發現支持 ALDH18A1 可能通過影響其蛋白表達水平，從而在食管癌中發揮功能，進一步擴展了對其作為臨床治療靶標的作用機制認識。
綜上，本研究采用測序方法揭示 ALDH18A1 結合靶標，結果顯示 ALDH18A1 結合的 mRNA 分子主要參與的生物學過程與腫瘤的發生發展密切相關。這為以后研究食管癌細胞中 ALDH18A1 相互作用的綜合調控提供了依據。然而，這些功能還未得到進一步驗證，為明確 ALDH18A1 在食管癌細胞中的具體作用，本研究小組將進一步通過 CCK-8 實驗和CTG實驗觀察目的基因對細胞的增殖能力和活力產生的影響，下一步將挑選潛在的靶標 RNA 進行互作實驗驗證。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
目前，關于食管癌的發病模式和關鍵病因尚不清晰[1]。研究表明，當食管細胞的基因表達過程發生變化（突變）時，其有可能發展成食管癌。近年來，RNA 結合蛋白（RNA binding protein, RBP）因在揭示各類疾病機制方面的重要作用而被關注[2-3]。進而，其在腫瘤中的作用也逐漸被重視。RBP 能與雙鏈或單鏈 RNA 結合，在轉錄和轉錄后調控中發揮關鍵作用。RBP 可以影響 RNA 的整個生命周期，包括剪接、修飾、翻譯、細胞內定位和降解等。通過這種機制，RNA 結合蛋白在腫瘤的發展中發揮著重要作用[4]。RBP 在各種人類癌癥中失調，對腫瘤的發展和進展有潛在的作用[5]。
醛脫氫酶 18 家族成員 A1（aldehyde dehydrogenase 18 family member A1，ALDH18A1）作為一種 RNA 結合蛋白，其具有結合靶標基因的 RNA 來調控靶標基因一系列生物學過程的能力。在乳腺癌中 ALDH18A1 作為人表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor-2, HER2）特異性 RNA 結合蛋白，它與乳腺癌的侵襲性相關[6-7]。ALDH18A1 能夠調控轉錄因子表達并參與轉錄調控過程。在神經母細胞瘤的生長中，ALDH18A1 在轉錄和轉錄后都能調節原癌基因的表達，從而 ALDH18A1 能夠作為神經母細胞瘤細胞增殖、自我更新和引起腫瘤發生的調節劑[8]。同時，ALDH18A1 表達水平上調與肺癌的發生和發展密切相關[9]。而敲低 ALDH18A1 靶向脯氨酸生物合成能顯著抑制黑色素瘤細胞和異種腫瘤的生長[10]。因而可推測 ALDH18A1 可能通過與信使 RNA（messenger RNA, mRNA）結合，從而調控食管癌相關基因的表達過程。因此，本文通過 RNA 免疫共沉淀測序（RNA immunoprecipitation sequencing, RIP-seq）技術鑒定食管癌細胞（KYSE150）中 ALDH18A1 結合的 RNA，以探究 ALDH18A1 在 KYSE150 細胞中作用靶標、影響基因表達和食管癌相關的生物學過程，為進一步研究食管癌細胞中 ALDH18A1 相互作用的綜合調控提供依據。
1 材料與方法
1.1 主要材料與儀器
RPMI-1640 培養基（北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清、鏈霉素和青霉素（美國賽默飛世爾科技公司）；無菌 1%磷酸緩沖鹽溶液（北京索萊寶科技有限公司）；Lipofectamine 2000 轉染試劑（美國賽默飛世爾科技公司）；總 RNA 提取試劑（北京索萊寶科技有限公司）；微球菌核酸酶（美國賽默飛世爾科技公司）；RQⅠ無核糖核酸酶活性 DNA 酶［普洛麥格（北京）生物技術有限公司］；特異性多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；蛋白酶 K（上海羅氏制藥有限公司）；Trizol 試劑（美國賽默飛世爾科技公司）；多聚核苷酸激酶緩沖液（美國賽默飛世爾科技公司）；KAPA RNA HyperPrep 試劑盒（上海羅氏制藥有限公司）；低溫超速離心機［大龍興創實驗儀器（北京）股份公司］；水平離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；NovaSeq 6000 基因測序儀（美國因美納公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
選用 KYSE150 細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）在 37°C、5%二氧化碳條件下，培養于含 10%胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素和 100 U/mL 青霉素的 RPMI-
1.2.2 細胞裂解和 RNA 片段處理
KYSE150 細胞以 400 mJ/cm2 照射 1 次，并在冰洗緩沖液中裂解。細胞裂解在冷洗緩沖液［1 倍標準濃度×磷酸緩沖鹽溶液（0.01 mol/L 濃度），0.1%十二烷基硫酸鈉，0.5% 乙基苯基聚乙二醇和 0.5%脫氧膽酸鈉］中進行，并添加 200 U/mL RNA 酶（RNase）抑制劑和蛋白酶抑制劑雞尾酒，并在冰上孵育 30 min。在 4℃條件下，離心半徑 8.4 cm，
1.2.3 免疫共沉淀
將上清液的 1%用于 Input（陽性對照組，未免疫沉淀）樣本，將上清液加入 10 μL ALDH18A1 抗體進行免疫沉淀，使用免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）G抗體作為陰性對照，4℃孵育過夜。將免疫沉淀物與蛋白 A/G 磁珠在 4℃下孵育 2 h。移除上清液后，依次使用裂解液、高鹽緩沖液和多聚核苷酸激酶緩沖液洗滌 2 次。將懸液 70°C 孵育 20 min，釋放含有交聯 RNA 和免疫沉淀的 RBP。將細胞裂解液轉移到一個干凈的 1.5 mL 微孔管中。將蛋白酶 K 加入到 Input 組和免疫沉淀的 RBP 與交聯 RNA 中，最終濃度為 1.2 mg/mL。在 55°C 下孵育 120 min。用 Trizol 試劑純化 RNA。
1.2.4 RIP -seq 文庫制備和測序
基因文庫（cDNA 文庫）采用 KAPA RNA HyperPrep 試劑盒，為 RNA 進行高通量測序文庫構建，依照說明程序制備 cDNA 文庫。對于高通量測序，文庫按照說明制備，并應用于 Illumina NovaSeq 測序系統 150 堿基對（base pairs, bp）雙端測序。
1.2.5 分析數據
采用快速將測序數據進行快速剪接映射的程序（TopHat 2）將序列比對到參考基因組上，僅使用唯一映射的讀段進行后續分析。采用“ABLIRC”策略（用于峰值調用和分析測序數據集的工作流程）鑒定 ALDH18A1 在基因組上的結合區域。通過模體分析軟件軟件（HOMER）調用免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）蛋白的結合基序。并通過對 RNA 免疫共沉淀組（ALDH18A1 IP 組）和 Input 組分別進行模擬分析，并去除與 Input 組峰重疊的 ALDH18A1 IP 組峰。最終通過峰關聯分析 ALDH18A1 的靶基因。
1.2.6 數據篩選
在數據分析過程中，具有至少 1 bp 重疊的讀數被聚為峰。對每個基因，計算模擬生成的測序序列，其數量和長度與峰中的測序序列相同。輸出序列進一步映射到相同基因，以從重疊的序列中生成隨機的最大峰值高度。全過程重復 500 次。選取觀測到的峰高高于隨機最大值的峰（P<0.05）。
1.2.7 功能富集分析
為了篩選出峰相關基因（靶基因）的功能類別，使用基因功能富集平臺 KOBAS 2.0 對其京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析。采用超幾何檢驗和 Benjamini-Hochberg 方法控制錯誤發現率（false discovery rate, FDR）控制程序來定義各項的富集程度[11]。
1.3 統計學方法
運用 GraphPad Prism9.0 軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用 t 檢驗。計數資料以頻數表示。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ALDH18A1 的 RNA 免疫共沉淀實驗
蛋白質免疫印跡實驗檢測免疫共沉淀效率見圖1。在 2 次重復實驗樣本中，目的蛋白被抗體較好富集，免疫共沉淀有效率，且樣本具有復現性。
圖1
蛋白質免疫印實驗檢測免疫共沉淀效率
Input：陽性對照；ALDH18A1 IP：醛脫氫酶 18 家族成員 A1 免疫共沉淀；IgG：免疫球蛋白G（陰性對照）；ALDH18A1：醛脫氫酶 18 家族成員 A1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶； Marker：標準蛋白分子量
2.2 高通量測序
通過對文庫行雙端 150 bp 測序，ALDH18A1 IP1、ALDH18A1 IP 2、 ALDH18A1 input 1 和 ALDH18A1 input 2 組得到的原始序列數分別為 54954362、51141638、50138652 和 53333480，而得到的有效序列數及其占原始序列數的比例分別為 49185406（89.50%）、45900183（89.75%）、42278596（84.32%）和 46763964（87.68%）。
同時，使用 TopHat2 軟件，比對到參考基因組的有效測序數據，結果顯示 ALDH18A1 IP1、ALDH18A1 IP2、ALDH18A1 input1 和 ALDH18A1 input2 組由測序得到的有效序列數能定位到基因組上的序列數及占比分別為 35372992（71.9 2%）、30357175（66.14%）、28459639（67.31%）和 31000823（66.29%），其中比對到有義鏈上的序列數占比為 89.77%、91.35%、77.82%和 84.08%，而比對到反義鏈上的序列數占比為 10.23%、8.65%、22.18%和 15.92%。
測序序列在基因組上的分布及占比見圖2。RNA 免疫共沉淀實驗質量控制較好，樣本具備復現性。測序序列在基因組各個分區情況結果顯示，相對于 input 組，ALDH18A1-IP 組的測序序列在編碼區、內含子和 5’非翻譯區區域明顯富集，內含子最顯著。
圖2
測序序列在基因組上的分布及占比
a. ALDH18A1 input 1 在不同區域的比例；b. ALDH18A1 input 2 在不同區域的比例；c. ALDH18A1 IP 1 在不同區域的比例；d. ALDH18A1 IP 2 在不同區域的比例；e. 全基因組的讀數分布條形圖。ALDH18A1：醛脫氫酶 18 家族成員 A1；Input：陽性對照；ALDH18A1 IP：醛脫氫酶 18 家族成員 A1 免疫共沉淀
2.3 結合峰分析
對 2 次重復實驗獲得的結合區域進行峰值識別，其結果顯示 2 次重復實驗獲得 8 258 個 ALDH18A1 結合區域（圖3a）。基序分析結果顯示，2 次重復實驗獲得的 ALDH18A1 的結合基序一致性較好，ALDH18A1 主要結合在 RNA 的 UGUAAUC 基序（圖3b）；且 UGUAAUC 基序也主要分布在內含子和編碼區（圖4）。
圖3
ALDH18A1 結合峰的情況
a. 維恩圖顯示 2 個實驗中得到的 ALDH18A1 結合峰的重疊情況；b. ALDH18A1 的前 5 個峰值首選結合基序。Rank：序列；Motif：基序
圖4
結合峰在基因組上的分布及占比
a.
2.4 結合峰相關基因 KEGG Pathway 富集分析
排名前 10 位的代謝通路的結合峰相關基因的功能 KEGG 分析見圖5。進一步對實驗中重復出現的 ALDH18A1 結合峰關聯的基因進行 KEGG 分析的結果表明，ALDH18A1 結合的 mRNA 分子主要參與了在對焦點黏附、癌癥的中心碳代謝、細胞周期、剪接體、RNA 運輸、泛素介導的蛋白水解等生物學過程高度富集（圖5）。
圖5
排名前 10 位的代謝通路的結合峰相關基因的功能 KEGG 分析
a. ALDH18A1 IP 1 結合峰相關的基因的 KEGG 分析；b. ALDH18A1 IP 2 結合峰相關的基因的 KEGG 聚類分析。代謝通路所對應的柱體越長說明該條目下基因數越多、富集后越顯著
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在哺乳動物體內，RNA 結合蛋白參與調控 mRNA 可變剪接，在腫瘤細胞內，可變剪接的功能紊亂是一種常見特性，其原因主要是 RBP 功能的改變[12]。RBP 也能夠調節腫瘤中轉錄本的多聚腺苷酸化和 mRNA 的穩定性。RBP 通過轉錄后調節靶 RNA 轉錄物的表達，在細胞生理學中發揮著關鍵作用。通過調節癌癥相關 mRNA 轉錄物的加工、穩定性和翻譯，大量 RBP 在各種類型的癌癥中發揮著重要作用[13-14]。RBP 活性的擾動與癌癥發展、腫瘤代謝、耐藥性、癌癥干細胞自我更新和腫瘤免疫逃避有因果關系。這種機制在建立和維持細胞極性上是非常關鍵的，而腫瘤細胞中該機制常常被改變[15]。在 mRNA 的翻譯過程中，RBP 對于誘導 mRNA 環化和翻譯激活是必不可少的，在癌癥中幾乎所有相關基因信號通路都會發生變化，這一過程與 RBP 調控 mRNA 的翻譯密不可分[16]。ALDH18A1 作為一種重要的 RNA 結合蛋白，在推動癌癥的發生發展過程中起著重要的作用。多項研究數據表明，ALDH18A1 與癌癥發生、發展和預后過程存在相關性[17-18]。鑒于以上基礎，本研究小組進行了一些研究以全面了解 ALDH18A1 在食道癌發生發展中的功能。
鑒于 RBP 在轉錄后調控中的關鍵作用，癌細胞可以合理地利用 RBP 功能障礙來調節各種癌癥相關轉錄本，從而獲得腫瘤發生優勢。在 mRNA 生命周期的每個階段，包括成熟（加帽、剪接和多聚腺苷酸化）、修飾、翻譯和衰變，與某些 RBP 的相互作用對細胞來說是極其動態和關鍵的，隨著越來越多的證據表明 RNA 經歷了許多修飾，這些修飾在正常和疾病發展中起著關鍵作用，RBP 的廣泛功能使它們在疾病發展過程中（尤其是癌癥）在 RBP-RNA 調節網絡中發揮著核心作用[19-20]。前體 mRNA 能夠通過可變剪接產生多種異構體，以執行相似或不同的生物學功能。可變剪接已被證明與許多疾病的發生有關，包括一些神經性疾病和腫瘤等，研究發現紫杉醇能夠促進上皮細胞轉化序列 2 發生可變剪接產生更短的剪接變體上皮細胞轉化序列 2-S，影響了 Wnt 通路和細胞增殖過程，從而抑制腫瘤進展[21]。可變剪接過程受到多種 RNA 結合蛋白的精密調控。然而，ALDH18A1 被發現作為一種潛在的 RBP，在 Hela 細胞中被發現 ALDH18A1 可作為 RNA 結合蛋白，并在某些情況下可調節其靶 mRNA 的表達從而影響不同的代謝途徑[22]。
在本研究中，相對于對照組，ALDH18A1-RNA 免疫共沉淀測序分析結果表明，ALDH 18A1 結合在編碼區、內含子和 5’非翻譯區的區域顯著富集；ALDH18A1 主要結合在 RNA 的 UGUAAUC 基序；結果表明 ALDH18A1 可能具有調控 mRNA 可變剪接功能。RIP-seq 數據綜合 KEGG 分析顯示，ALDH18A1 結合的 mRNA 分子參與了多種重要途徑，包括在對焦點黏附、癌癥的中心碳代謝、細胞周期、剪接體、RNA 運輸和泛素介導的蛋白水解等生物學過程高度富集。因此，ALDH18A1 可能影響食管癌相關的生物學過程。本研究對于 ALDH18A1 的功能，及其在食管癌細胞中的作用提供了新的數據支持和研究方向。
總的來說，RIP-seq 方法可確定被 RNA 結合蛋白結合的完整的 RNA 生物分子。在此，本研究從 RIP-seq 結果中確定了 ALDH18A1 蛋白的結合峰和基序，分析了結合峰相關基因相關的生物學過程。因此，可推測 ALDH18A1 可調節 KYSE150 細胞的選擇性剪接。這些發現支持 ALDH18A1 可能通過影響其蛋白表達水平，從而在食管癌中發揮功能，進一步擴展了對其作為臨床治療靶標的作用機制認識。
綜上，本研究采用測序方法揭示 ALDH18A1 結合靶標，結果顯示 ALDH18A1 結合的 mRNA 分子主要參與的生物學過程與腫瘤的發生發展密切相關。這為以后研究食管癌細胞中 ALDH18A1 相互作用的綜合調控提供了依據。然而，這些功能還未得到進一步驗證，為明確 ALDH18A1 在食管癌細胞中的具體作用，本研究小組將進一步通過 CCK-8 實驗和CTG實驗觀察目的基因對細胞的增殖能力和活力產生的影響，下一步將挑選潛在的靶標 RNA 進行互作實驗驗證。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
