引用本文： 夏慶玲, 李艷, 康婷, 朱婷婷, 吳蔚樺, 歐三桃. 鳶尾素在腺嘌呤誘導慢性腎病大鼠模型中的表達及意義. 華西醫學, 2024, 39(2): 268-274. doi: 10.7507/1002-0179.202308009 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《華西醫學》版權所有，未經授權不得轉載、改編
腎纖維化（renal fibrosis, RF）是細胞外基質在腎臟廣泛沉積引起的病理改變，主要包括腎小球硬化、間質纖維化及動脈硬化等，是發展為終末期腎病的最主要病理改變和共同通路。延緩 RF 是防止各種慢性腎臟疾病進展的中心環節[1]，但其發病機制目前仍不完全清楚，也缺乏針對的特異靶向治療。鳶尾素是一種新發現的肌細胞因子，Ⅲ型纖連蛋白結構域蛋白 5（recombinant fibronectin type Ⅲ domain containing protein 5, Fndc5）是鳶尾素的前體，其水解生成鳶尾素，后以同型二聚體形式存在于血液循環中[2]。鳶尾素與肝臟[3]、心臟[4]、胰腺纖維化[5]密切相關，但對 RF 的研究較少，僅少量研究發現鳶尾素可通過抑制轉化生長因子-β家族（transforming growth factor-β, TGF-β）/smad 途徑減輕 RF [6]。骨形態發生蛋白 7（bone morphogenetic protein 7, BMP7）是 TGF-β的成員之一，是一種重要的抗纖維化因子[7]，以 TGF-β途徑依賴的方式，通過其下游的 Smad 信號通路參與調節 RF。BMP-7 可通過啟動 Smad1 抑制 TGF-β信號傳導減輕 RF [8]。目前尚無研究探討鳶尾素、BMP7/Smad1 信號通路與 RF 的相關性。因此，本研究探討了腺嘌呤誘導慢性腎病（chronic kidney disease, CKD）大鼠模型中鳶尾素的表達水平變化，及是否可通過調節 BMP7/Smad1 信號通路參與 RF 進程，從而為其防治提供新靶點。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
購自西南醫科大學實驗動物中心的 8 周齡雄性無特定病原體（SPF）級 SD 大鼠 20 只，體重（200±20）g，生產許可證號為 SCXK（川）2018-17，使用許可證號為 SYXK（川）2018-065，并遵循實驗動物的 3R 原則，已通過西南醫科大學實驗動物福利倫理審查（swmu20230062）。
1.1.2 主要試劑與儀器
腺嘌呤（美國 Sigma 公司）；α-SMA 抗體（美國 CST 公司）；Col-Ⅰ抗體（中國博士德生物公司）；BMP7 抗體（中國武漢三鷹公司）；Smad1 抗體（中國博士德生物公司）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining, HE）染色試劑盒（中國碧云天公司）；Masson 染色試劑盒（中國珠海貝索公司）；兔二步法檢測試劑盒（中國中杉金橋公司）；二氨基聯苯胺法顯色試劑盒（中國索萊寶公司）；組織中總 RNA 提取、逆轉錄、實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒（中國諾維贊公司）；光學顯微鏡（日本尼康公司）；全自動酶標儀（美國伯騰公司）；RNA 逆轉錄儀、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）核酸擴增儀（德國艾本德公司）。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物分組與模型建立
20 只 SD 雄性大鼠經過適應喂養，采用簡單隨機法將其分為對照組和模型組（CKD 組），每組各 10 只。CKD 組給予 2.5%的腺嘌呤 250 mg/（kg·d）灌胃，對照組給予相應劑量 0.9%氯化鈉灌胃。
1.2.2 實驗標本的收集
于建模后第 2、4 周末分別從兩組大鼠中每組隨機選取 5 只于代謝籠中收集 24 h 尿液，用于檢測 24 h 蛋白尿定量；在戊巴比妥鈉麻醉狀態下經腹主動脈采血留取血液標本，用于檢測血清肌酐、尿素氮、鳶尾素、BMP7 水平；留取腎臟組織標本，將其縱切為 2 個部分，其中一部分置于 4%多聚甲醛液浸泡固定，用于石蠟包埋進行病理染色，另一部分即置于 RNA 保存液中保存，儲存于?80℃用于腎臟組織信使 RNA（messenger RNA, mRNA）檢測。
1.2.3 腎臟組織 HE 染色
石蠟包埋腎臟組織切 4 μm 薄片，置于 65℃烘箱 2 h，常規脫蠟至水，使用蘇木素染液染細胞核 5 min，伊紅染色液染細胞質 30 s，脫水透明后中性樹膠封片，最后于光鏡下（200 倍）觀察、拍片。
1.2.4 腎臟組織 Masson 染色
石蠟薄片 65℃烤 2 h，常規脫蠟至水，鐵蘇木素混合液染 8 min、麗春紅染 7 min、磷鉬酸分色 4 min、甲苯胺藍染 4 min，1%冰醋酸沖洗 2 min，脫水透明后中性樹膠封片，最后于光鏡下（200 倍）觀察、拍片。
1.2.5 免疫組織化學
將保存于 4%多聚甲醛液中的腎臟組織進行石蠟包埋，石蠟切片置于 65℃孵箱中 2 h，常規脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）沖洗，置于檸檬酸三鈉緩沖液中采取微波爐中火進行抗原修復，自然冷卻后滴加 3%過氧化物酶阻斷劑于切片上避光室溫孵育 10 min 阻斷內源性過氧化物酶，PBS 緩沖液沖洗，室溫下 10%山羊血清封閉 10 min 減少非特異染色，分別滴加一抗α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1，其稀釋倍數均為 1∶200，4℃過夜孵育一抗，PBS 沖洗，滴加二抗室溫孵育 20 min，辣根標記過氧化物酶 20 min，PBS 沖洗后使用二氨基聯苯胺法工作液鏡下控制顯色，終止顯色后蘇木素復染 20 s，經脫水、脫蠟、晾干后封片，最后于光鏡下（200 倍）進行觀察和拍片，采用 image J 軟件進行半定量分析。
1.2.6 腎臟組織總 RNA 提取及實時熒光定量 PCR
取 50 mg 腎組織塊加入 1 mL Trizol 充分裂解，按 RNA 提取說明書按步驟提取 RNA 并測定 RNA 濃度及質量，使用逆轉錄試劑逆轉錄為成 cDNA 后實時熒光定量 PCR 試劑盒進行 PCR 擴增。引物由上海生工公司合成，序列見表1。
表1
實時熒光定量 PCR 各基因引物序列
1.2.7 基因表達驗證
利用基因表達綜合（Gene Expression Omnibus, GEO）數據庫搜索腺嘌呤誘導的 CKD 模型基因芯片驗證。
1.3 統計學方法
使用 GraphPad Prism 9.0 軟件進行數據分析。呈正態分布的計量資料以均數±標準差表示，采用獨立樣本 t 檢驗進行組間比較。血清鳶尾素分別與 α-SMA、Col-Ⅰ、血清 BMP7 的相關性，及腎臟組織 BMP7 與 Smad1 的相關性分析采用 Pearson 檢驗。計數資料以只數和百分比表示。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠生化指標、血清鳶尾素和 BMP7 水平變化
兩組大鼠生化指標、血清鳶尾素和 BMP7 水平變化見表2。組間比較顯示，在建模后第 2、4 周末時，CKD 組大鼠的血清肌酐、尿素氮及 24 h 蛋白尿定量水平均高于對照組（P<0.05），血清鳶尾素和 BMP7 均低于對照組（P<0.05）。組內比較顯示，在建模后第 4 周末時，CKD 組的血清肌酐、尿素氮及 24 h 蛋白尿定量水平均高于建模后第 2 周末（P<0.05），血清鳶尾素和 BMP7 均低于建模后第 2 周末（P<0.05）。
表2
兩組大鼠生化指標及血清鳶尾素和 BMP7 水平變化（x±s）
2.2 大鼠腎臟病理情況
兩組大鼠腎臟組織染色彩色像見圖1。由圖1a 可見，對照組大鼠腎臟組織中各結構均未見明顯異常；CKD 組可見腎臟組織結構紊亂，并隨著時間進展，可見腎小球萎縮、數量減少，腎小管管腔明顯擴張、斷裂，管腔內棕黃色沉積增多。由圖1b 可見，對照組大鼠腎間質未見明顯膠原纖維沉積；CKD 組腎間質可見大量藍色膠原纖維沉積，并隨著時間進展加重。
圖1
兩組大鼠腎臟組織染色彩色像（×200）
a. HE 染色；b. Masson 染色
2.3 大鼠腎臟組織α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1 蛋白表達水平變化
兩組大鼠腎臟組織 α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1 蛋白表達水平變化見圖2、表3。組間比較顯示，在建模后第 2、4 周末時，CKD 組的α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達水平均高于對照組（P<0.05），BMP7、Smad1 蛋白表達均低于對照組（P<0.05）。組內比較顯示，在建模后第 4 周末時，CKD 組的α-SMA、Col-Ⅰ 蛋白表達水平均高于建模后第 2 周末（P<0.05），BMP7、Smad1 蛋白表達水平均低于建模后第 2 周末（P<0.05）。
圖2
兩組大鼠腎臟α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1 免疫組織化學染色圖
a. α-SMA；b. Col-Ⅰ；c. BMP7；d. Smad1
表3
兩組大鼠腎臟α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1 蛋白表達水平（x±s）
2.4 大鼠腎臟組織α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1 mRNA 表達水平
兩組大鼠腎臟組織α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1 mRNA 表達水平見表4。組間比較顯示，在建模后第 2、4 周末，CKD 組大鼠的α-SMA、Col-Ⅰ mRNA 表達水平均高于對照組（P<0.05），BMP7、Smad1 mRNA 表達水平均低于對照組（P<0.05）。組內比較顯示，在建模后第 4 周末時，CKD 組的α-SMA、Col-Ⅰ mRNA 表達水平均高于建模后第 2 周末（P<0.05），BMP7、Smad1 mRNA 表達水平均低于建模后第 2 周末（P<0.05）。
表4
兩組大鼠腎臟α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1 mRNA 表達水平（x±s）
2.5 大鼠各指標間相關性分析
血清鳶尾素與 α-SMA、 Col-Ⅰ 均呈負相關（r=?0.917、?0.902，P<0.001），與血清 BMP7 呈正相關（r=0.842，P<0.001）；腎臟組織 BMP7 與 Smad1 呈正相關（r=0.884，P<0.001）。
2.6 CKD 基因數據分析
利用 GEO 數據庫下載腺嘌呤誘導的 CKD 模型 GSE221598 基因芯片進行驗證，篩選出目的基因進行熱圖分析結果（圖3）顯示，與對照組相比，CKD 組中 BMP7 及鳶尾素的前體 Fndc5 表達下調，α-SMA 和 Col-Ⅰ表達上調（圖3a）；Fndc5 與 BMP7 呈正相關，與 Col-Ⅰ、α-SMA 呈負相關（圖3b）。
圖3
目的基因熱圖分析
a. 各目的基因在腺嘌呤誘導的 CKD 模型中的表達情況；b. 腺嘌呤誘導的 CKD 模型中各目的基因相關性分析。熱圖中方格的紅色越深，表示相對豐度或相關性越強；藍色越深表示相對豐度或相關性越弱。CKD：慢性腎病
3 討論
RF 是由損傷、炎癥、缺氧等多種致病因素參與的多種類型的腎臟疾病的共同病理變化，主要表現為細胞外基質在腎間質、系膜等處的沉積[9-10]，進行性的 RF 最終會導致嚴重且不可逆的腎臟功能衰竭。RF 的發病機制尚未明確，目前臨床上缺乏有效的手段逆轉，對新的相關信號通路進一步探索，有助于了解 RF 的發生機制，有助于發現防治 RF 的新方法。
采用低劑量腺嘌呤灌胃誘導 CKD 大鼠是研究病理機制理想的動物模型，其損傷更接近于臨床上 RF 的發生發展進程[11]。本研究采用該方法進行建模，可見與對照組相比，CKD 組大鼠血清肌酐和尿素氮水平明顯升高，Masson 染色見腎間質大量膠原纖維沉積，纖維化標志物α-SMA、Col-Ⅰ的蛋白及 mRNA 表達水平均升高，且隨著病程進展逐漸加重，表明成功建立了 CKD 的 RF 模型。
鳶尾素是一種釋放于血液循環中的新型肌細胞因子，參與糖脂代謝、氧化應激、炎癥、神經分化、腫瘤轉移等過程[12-13]。Zhang 等[14]研究發現鳶尾素可保護腎線粒體功能，改善腎臟能量代謝，并減少腎臟氧化應激和炎癥，提示其具有腎臟保護作用，并可能成為未來有效治療腎臟疾病的新靶點。有研究表明，鳶尾素可通過 TGF-β/Smad 信號通路改善肝臟、心臟、胰腺等臟器纖維化，但鳶尾素在 RF 中的研究相對較少。Jiang 等[15]發現鳶尾素可抑制腎臟細胞外基質的堆積。研究顯示在葉酸誘導的 RF 模型中，鳶尾素可通過抑制 TGF-β/Smad 信號通路，改善腎臟能量代謝并抑制 RF[6]。本研究亦發現，CKD 組大鼠血清鳶尾素水平低于對照組，并隨著時間進展降低；利用 GEO 數據庫對腺嘌呤誘導的 CKD 模型的 RNA 數據進行分析提示 CKD 組中鳶尾素的前體 Fndc5 表達下調，而α-SMA 和 Col-Ⅰ表達上調，提示鳶尾素可能參與 CKD 的 RF 發生發展，值得進一步深入探討。
BMP7 是 TGF-β超家族中 BMP 家族的一員，被認為是一種抗 TGF-β樣因子[16]，外源性使用 BMP7 可減少腎小管上皮細胞凋亡及細胞外基質沉積，發揮一定的抗 RF 作用[17]。Smads 蛋白是 TGF-β家族下游的信號轉導蛋白，BMP7 主要通過 Smad 蛋白介導的經典途徑和獨立于 Smad 蛋白的非經典途徑發揮作用[18]。目前有研究表明，BMP7 可通過啟動 Smad1 減輕 RF[17，19-20]。本研究發現 CKD 組大鼠腎臟的 BMP7 和 Smad1 的蛋白和 mRNA 表達水平均低于對照組，血清鳶尾素和 BMP7 水平低于對照組，且在腺嘌呤誘導 RF 形成的早期即可檢測出血清鳶尾素水平在 CKD 組與對照組的顯著變化，表明在 RF 形成的早期階段，鳶尾素已可發揮防治作用，并其作用可持續到 RF 晚期。對腺嘌呤誘導的 CKD 模型的 RNA 測序結果進行分析同樣提示，與對照組相比，CKD 組鳶尾素的前體 Fndc5 和 BMP7 表達下調，α-SMA 和 Col-Ⅰ表達上調。對鳶尾素和 BMP7 進行相關性分析提示血清鳶尾素和 BMP7 水平呈正相關，而腎組織 BMP7 與 Smad1 呈正相關。因此，可推測鳶尾素可能通過影響 BMP7/Smad1 發揮抗 RF 作用。
綜上所述，本研究通過建立腺嘌呤誘導的 CKD 的 RF 模型，提示鳶尾素可能參與了 RF 的進程，并且可能通過調節 BMP7/smad1 信號通路發揮抗 RF 作用，有望成為 RF 防治的新靶點。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
腎纖維化（renal fibrosis, RF）是細胞外基質在腎臟廣泛沉積引起的病理改變，主要包括腎小球硬化、間質纖維化及動脈硬化等，是發展為終末期腎病的最主要病理改變和共同通路。延緩 RF 是防止各種慢性腎臟疾病進展的中心環節[1]，但其發病機制目前仍不完全清楚，也缺乏針對的特異靶向治療。鳶尾素是一種新發現的肌細胞因子，Ⅲ型纖連蛋白結構域蛋白 5（recombinant fibronectin type Ⅲ domain containing protein 5, Fndc5）是鳶尾素的前體，其水解生成鳶尾素，后以同型二聚體形式存在于血液循環中[2]。鳶尾素與肝臟[3]、心臟[4]、胰腺纖維化[5]密切相關，但對 RF 的研究較少，僅少量研究發現鳶尾素可通過抑制轉化生長因子-β家族（transforming growth factor-β, TGF-β）/smad 途徑減輕 RF [6]。骨形態發生蛋白 7（bone morphogenetic protein 7, BMP7）是 TGF-β的成員之一，是一種重要的抗纖維化因子[7]，以 TGF-β途徑依賴的方式，通過其下游的 Smad 信號通路參與調節 RF。BMP-7 可通過啟動 Smad1 抑制 TGF-β信號傳導減輕 RF [8]。目前尚無研究探討鳶尾素、BMP7/Smad1 信號通路與 RF 的相關性。因此，本研究探討了腺嘌呤誘導慢性腎病（chronic kidney disease, CKD）大鼠模型中鳶尾素的表達水平變化，及是否可通過調節 BMP7/Smad1 信號通路參與 RF 進程，從而為其防治提供新靶點。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
購自西南醫科大學實驗動物中心的 8 周齡雄性無特定病原體（SPF）級 SD 大鼠 20 只，體重（200±20）g，生產許可證號為 SCXK（川）2018-17，使用許可證號為 SYXK（川）2018-065，并遵循實驗動物的 3R 原則，已通過西南醫科大學實驗動物福利倫理審查（swmu20230062）。
1.1.2 主要試劑與儀器
腺嘌呤（美國 Sigma 公司）；α-SMA 抗體（美國 CST 公司）；Col-Ⅰ抗體（中國博士德生物公司）；BMP7 抗體（中國武漢三鷹公司）；Smad1 抗體（中國博士德生物公司）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining, HE）染色試劑盒（中國碧云天公司）；Masson 染色試劑盒（中國珠海貝索公司）；兔二步法檢測試劑盒（中國中杉金橋公司）；二氨基聯苯胺法顯色試劑盒（中國索萊寶公司）；組織中總 RNA 提取、逆轉錄、實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒（中國諾維贊公司）；光學顯微鏡（日本尼康公司）；全自動酶標儀（美國伯騰公司）；RNA 逆轉錄儀、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）核酸擴增儀（德國艾本德公司）。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物分組與模型建立
20 只 SD 雄性大鼠經過適應喂養，采用簡單隨機法將其分為對照組和模型組（CKD 組），每組各 10 只。CKD 組給予 2.5%的腺嘌呤 250 mg/（kg·d）灌胃，對照組給予相應劑量 0.9%氯化鈉灌胃。
1.2.2 實驗標本的收集
于建模后第 2、4 周末分別從兩組大鼠中每組隨機選取 5 只于代謝籠中收集 24 h 尿液，用于檢測 24 h 蛋白尿定量；在戊巴比妥鈉麻醉狀態下經腹主動脈采血留取血液標本，用于檢測血清肌酐、尿素氮、鳶尾素、BMP7 水平；留取腎臟組織標本，將其縱切為 2 個部分，其中一部分置于 4%多聚甲醛液浸泡固定，用于石蠟包埋進行病理染色，另一部分即置于 RNA 保存液中保存，儲存于?80℃用于腎臟組織信使 RNA（messenger RNA, mRNA）檢測。
1.2.3 腎臟組織 HE 染色
石蠟包埋腎臟組織切 4 μm 薄片，置于 65℃烘箱 2 h，常規脫蠟至水，使用蘇木素染液染細胞核 5 min，伊紅染色液染細胞質 30 s，脫水透明后中性樹膠封片，最后于光鏡下（200 倍）觀察、拍片。
1.2.4 腎臟組織 Masson 染色
石蠟薄片 65℃烤 2 h，常規脫蠟至水，鐵蘇木素混合液染 8 min、麗春紅染 7 min、磷鉬酸分色 4 min、甲苯胺藍染 4 min，1%冰醋酸沖洗 2 min，脫水透明后中性樹膠封片，最后于光鏡下（200 倍）觀察、拍片。
1.2.5 免疫組織化學
將保存于 4%多聚甲醛液中的腎臟組織進行石蠟包埋，石蠟切片置于 65℃孵箱中 2 h，常規脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）沖洗，置于檸檬酸三鈉緩沖液中采取微波爐中火進行抗原修復，自然冷卻后滴加 3%過氧化物酶阻斷劑于切片上避光室溫孵育 10 min 阻斷內源性過氧化物酶，PBS 緩沖液沖洗，室溫下 10%山羊血清封閉 10 min 減少非特異染色，分別滴加一抗α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1，其稀釋倍數均為 1∶200，4℃過夜孵育一抗，PBS 沖洗，滴加二抗室溫孵育 20 min，辣根標記過氧化物酶 20 min，PBS 沖洗后使用二氨基聯苯胺法工作液鏡下控制顯色，終止顯色后蘇木素復染 20 s，經脫水、脫蠟、晾干后封片，最后于光鏡下（200 倍）進行觀察和拍片，采用 image J 軟件進行半定量分析。
1.2.6 腎臟組織總 RNA 提取及實時熒光定量 PCR
取 50 mg 腎組織塊加入 1 mL Trizol 充分裂解，按 RNA 提取說明書按步驟提取 RNA 并測定 RNA 濃度及質量，使用逆轉錄試劑逆轉錄為成 cDNA 后實時熒光定量 PCR 試劑盒進行 PCR 擴增。引物由上海生工公司合成，序列見表1。
表1
實時熒光定量 PCR 各基因引物序列
1.2.7 基因表達驗證
利用基因表達綜合（Gene Expression Omnibus, GEO）數據庫搜索腺嘌呤誘導的 CKD 模型基因芯片驗證。
1.3 統計學方法
使用 GraphPad Prism 9.0 軟件進行數據分析。呈正態分布的計量資料以均數±標準差表示，采用獨立樣本 t 檢驗進行組間比較。血清鳶尾素分別與 α-SMA、Col-Ⅰ、血清 BMP7 的相關性，及腎臟組織 BMP7 與 Smad1 的相關性分析采用 Pearson 檢驗。計數資料以只數和百分比表示。雙側檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠生化指標、血清鳶尾素和 BMP7 水平變化
兩組大鼠生化指標、血清鳶尾素和 BMP7 水平變化見表2。組間比較顯示，在建模后第 2、4 周末時，CKD 組大鼠的血清肌酐、尿素氮及 24 h 蛋白尿定量水平均高于對照組（P<0.05），血清鳶尾素和 BMP7 均低于對照組（P<0.05）。組內比較顯示，在建模后第 4 周末時，CKD 組的血清肌酐、尿素氮及 24 h 蛋白尿定量水平均高于建模后第 2 周末（P<0.05），血清鳶尾素和 BMP7 均低于建模后第 2 周末（P<0.05）。
表2
兩組大鼠生化指標及血清鳶尾素和 BMP7 水平變化（x±s）
2.2 大鼠腎臟病理情況
兩組大鼠腎臟組織染色彩色像見圖1。由圖1a 可見，對照組大鼠腎臟組織中各結構均未見明顯異常；CKD 組可見腎臟組織結構紊亂，并隨著時間進展，可見腎小球萎縮、數量減少，腎小管管腔明顯擴張、斷裂，管腔內棕黃色沉積增多。由圖1b 可見，對照組大鼠腎間質未見明顯膠原纖維沉積；CKD 組腎間質可見大量藍色膠原纖維沉積，并隨著時間進展加重。
圖1
兩組大鼠腎臟組織染色彩色像（×200）
a. HE 染色；b. Masson 染色
2.3 大鼠腎臟組織α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1 蛋白表達水平變化
兩組大鼠腎臟組織 α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1 蛋白表達水平變化見圖2、表3。組間比較顯示，在建模后第 2、4 周末時，CKD 組的α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達水平均高于對照組（P<0.05），BMP7、Smad1 蛋白表達均低于對照組（P<0.05）。組內比較顯示，在建模后第 4 周末時，CKD 組的α-SMA、Col-Ⅰ 蛋白表達水平均高于建模后第 2 周末（P<0.05），BMP7、Smad1 蛋白表達水平均低于建模后第 2 周末（P<0.05）。
圖2
兩組大鼠腎臟α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1 免疫組織化學染色圖
a. α-SMA；b. Col-Ⅰ；c. BMP7；d. Smad1
表3
兩組大鼠腎臟α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1 蛋白表達水平（x±s）
2.4 大鼠腎臟組織α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1 mRNA 表達水平
兩組大鼠腎臟組織α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1 mRNA 表達水平見表4。組間比較顯示，在建模后第 2、4 周末，CKD 組大鼠的α-SMA、Col-Ⅰ mRNA 表達水平均高于對照組（P<0.05），BMP7、Smad1 mRNA 表達水平均低于對照組（P<0.05）。組內比較顯示，在建模后第 4 周末時，CKD 組的α-SMA、Col-Ⅰ mRNA 表達水平均高于建模后第 2 周末（P<0.05），BMP7、Smad1 mRNA 表達水平均低于建模后第 2 周末（P<0.05）。
表4
兩組大鼠腎臟α-SMA、Col-Ⅰ、BMP7、Smad1 mRNA 表達水平（x±s）
2.5 大鼠各指標間相關性分析
血清鳶尾素與 α-SMA、 Col-Ⅰ 均呈負相關（r=?0.917、?0.902，P<0.001），與血清 BMP7 呈正相關（r=0.842，P<0.001）；腎臟組織 BMP7 與 Smad1 呈正相關（r=0.884，P<0.001）。
2.6 CKD 基因數據分析
利用 GEO 數據庫下載腺嘌呤誘導的 CKD 模型 GSE221598 基因芯片進行驗證，篩選出目的基因進行熱圖分析結果（圖3）顯示，與對照組相比，CKD 組中 BMP7 及鳶尾素的前體 Fndc5 表達下調，α-SMA 和 Col-Ⅰ表達上調（圖3a）；Fndc5 與 BMP7 呈正相關，與 Col-Ⅰ、α-SMA 呈負相關（圖3b）。
圖3
目的基因熱圖分析
a. 各目的基因在腺嘌呤誘導的 CKD 模型中的表達情況；b. 腺嘌呤誘導的 CKD 模型中各目的基因相關性分析。熱圖中方格的紅色越深，表示相對豐度或相關性越強；藍色越深表示相對豐度或相關性越弱。CKD：慢性腎病
3 討論
RF 是由損傷、炎癥、缺氧等多種致病因素參與的多種類型的腎臟疾病的共同病理變化，主要表現為細胞外基質在腎間質、系膜等處的沉積[9-10]，進行性的 RF 最終會導致嚴重且不可逆的腎臟功能衰竭。RF 的發病機制尚未明確，目前臨床上缺乏有效的手段逆轉，對新的相關信號通路進一步探索，有助于了解 RF 的發生機制，有助于發現防治 RF 的新方法。
采用低劑量腺嘌呤灌胃誘導 CKD 大鼠是研究病理機制理想的動物模型，其損傷更接近于臨床上 RF 的發生發展進程[11]。本研究采用該方法進行建模，可見與對照組相比，CKD 組大鼠血清肌酐和尿素氮水平明顯升高，Masson 染色見腎間質大量膠原纖維沉積，纖維化標志物α-SMA、Col-Ⅰ的蛋白及 mRNA 表達水平均升高，且隨著病程進展逐漸加重，表明成功建立了 CKD 的 RF 模型。
鳶尾素是一種釋放于血液循環中的新型肌細胞因子，參與糖脂代謝、氧化應激、炎癥、神經分化、腫瘤轉移等過程[12-13]。Zhang 等[14]研究發現鳶尾素可保護腎線粒體功能，改善腎臟能量代謝，并減少腎臟氧化應激和炎癥，提示其具有腎臟保護作用，并可能成為未來有效治療腎臟疾病的新靶點。有研究表明，鳶尾素可通過 TGF-β/Smad 信號通路改善肝臟、心臟、胰腺等臟器纖維化，但鳶尾素在 RF 中的研究相對較少。Jiang 等[15]發現鳶尾素可抑制腎臟細胞外基質的堆積。研究顯示在葉酸誘導的 RF 模型中，鳶尾素可通過抑制 TGF-β/Smad 信號通路，改善腎臟能量代謝并抑制 RF[6]。本研究亦發現，CKD 組大鼠血清鳶尾素水平低于對照組，并隨著時間進展降低；利用 GEO 數據庫對腺嘌呤誘導的 CKD 模型的 RNA 數據進行分析提示 CKD 組中鳶尾素的前體 Fndc5 表達下調，而α-SMA 和 Col-Ⅰ表達上調，提示鳶尾素可能參與 CKD 的 RF 發生發展，值得進一步深入探討。
BMP7 是 TGF-β超家族中 BMP 家族的一員，被認為是一種抗 TGF-β樣因子[16]，外源性使用 BMP7 可減少腎小管上皮細胞凋亡及細胞外基質沉積，發揮一定的抗 RF 作用[17]。Smads 蛋白是 TGF-β家族下游的信號轉導蛋白，BMP7 主要通過 Smad 蛋白介導的經典途徑和獨立于 Smad 蛋白的非經典途徑發揮作用[18]。目前有研究表明，BMP7 可通過啟動 Smad1 減輕 RF[17，19-20]。本研究發現 CKD 組大鼠腎臟的 BMP7 和 Smad1 的蛋白和 mRNA 表達水平均低于對照組，血清鳶尾素和 BMP7 水平低于對照組，且在腺嘌呤誘導 RF 形成的早期即可檢測出血清鳶尾素水平在 CKD 組與對照組的顯著變化，表明在 RF 形成的早期階段，鳶尾素已可發揮防治作用，并其作用可持續到 RF 晚期。對腺嘌呤誘導的 CKD 模型的 RNA 測序結果進行分析同樣提示，與對照組相比，CKD 組鳶尾素的前體 Fndc5 和 BMP7 表達下調，α-SMA 和 Col-Ⅰ表達上調。對鳶尾素和 BMP7 進行相關性分析提示血清鳶尾素和 BMP7 水平呈正相關，而腎組織 BMP7 與 Smad1 呈正相關。因此，可推測鳶尾素可能通過影響 BMP7/Smad1 發揮抗 RF 作用。
綜上所述，本研究通過建立腺嘌呤誘導的 CKD 的 RF 模型，提示鳶尾素可能參與了 RF 的進程，并且可能通過調節 BMP7/smad1 信號通路發揮抗 RF 作用，有望成為 RF 防治的新靶點。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
