周圍神經損傷（peripheral nerve injury, PNI）是一種常見的神經功能障礙。臨床中通過自體神經移植解決 PNI 相關供體資源有限、神經瘤形成和供體發病率高等問題。因此，尋找新的神經再生材料成為研究的熱點。脫細胞基質（decellularized extracellular matrix, dECM）水凝膠通過去除生物組織中的細胞成分，保留細胞外基質，為神經再生提供支架，是一種有潛力的神經再生治療材料。該文綜述了 dECM 水凝膠在 PNI 治療方面的研究進展，并展望了該研究方向的臨床前景。
引用本文： 劉業祖, 劉如恩. 脫細胞基質水凝膠治療周圍神經損傷的研究進展. 華西醫學, 2024, 39(7): 1145-1150. doi: 10.7507/1002-0179.202403130 復制
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周圍神經損傷（peripheral nerve injury, PNI）是一種常見的神經功能障礙，可能由多種因素引起，包括牽拉、擠壓、切割、手術麻醉等[1]。其可能導致感覺喪失、運動功能障礙甚至殘疾[2]。傳統的治療方法如自體神經移植存在供體部位損傷和有限供應等問題，因此尋找新的治療策略尤為重要[3]。脫細胞基質（decellularized extracellular matrix, dECM）水凝膠因其獨特的生物相容性、生物活性、可塑性和降解性，在組織工程和再生醫學領域受到了廣泛關注[4-5]。在國際上，dECM 水凝膠已被廣泛研究用于多種組織工程，如皮膚、骨與軟骨、腎臟、心臟、肝臟等[6-14]。許多研究表明，dECM 水凝膠能夠提供物理支持和生物化學信號，促進神經細胞的增殖和分化，加速神經再生過程[15-16]。本文綜述了當前 dECM 水凝膠在治療 PNI 方面的研究進展，包含 PNI 的背景介紹和 dECM 的制備、dECM 治療 PNI、dECM 對施萬細胞及軸突生長的影響和 dECM 在 PNI 動物模型中的治療效果等內容。
1 PNI 概述
1.1 PNI 及其再生
當發生 PNI 時，遠側斷端細胞骨架及細胞膜崩解，施萬細胞去髓鞘化，轉變為增殖細胞，與巨噬細胞一同清除損傷處周圍的細胞碎片，同時施萬細胞增殖、相互融合，形成 Bungner 帶，為軸突的再生及遠端橋接創造條件，此過程為沃勒變性[17]。在損傷近端斷端則形成生長錐，作為再生軸突的前體，它會沿著 Bungner 管延伸并重新與遠端靶器官形成再神經支配[18]。
1.2 軸突損傷的信號傳導
當 PNI 發生后，相關損傷信號會通過幾個信號傳導通路逆行傳送至細胞核[19]，其中關鍵步驟是由輸入蛋白、信號轉導及轉錄激活蛋白 3 及其他蛋白質形成的逆行損傷信號分子復合體完成[20]。為快速響應軸突再生過程，輸入蛋白、信號轉導及轉錄激活蛋白 3 必須在軸突損傷處局部翻譯，該過程與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）的局部上調相關。在大鼠坐骨損傷模型中 mTOR 在損傷軸突的含量在損傷后 3 h 內顯著升高，使用 mTOR 抑制劑 torin-1 可明顯減少損傷神經元的損傷信號分子的局部上調[21]，導致損傷后再生的神經元數量減少。胞體在接收到相關損傷逆行信號后進行整合，并上調再生相關基因以修復受損軸突[22]。
1.3 肌肉失神經萎縮
肌肉的失神經萎縮是一個慢性過程，最主要的變化是肌肉收縮功能的降低和肌肉纖維數量的減少等[23]。但即使是神經再連接的肌肉組織，其運動功能也不能完全恢復，這個結果被認為與神經-肌肉連接的再生有關，相關研究表明即使軸突成功再生，其與肌肉組織的突觸連接再生失敗也會導致運動功能的喪失[24]。所以在治療中應重視失神經后的靶器官保護，而在長期失神經萎縮的肌肉組織中，骨骼肌干細胞仍然保留著再生潛力，這讓肌肉失神經后運動功能的恢復成為可能。
1.4 PNI 的治療方法
PNI 的治療原則是恢復神經斷端的連接，并使其支配的肌肉恢復運動功能，目前對于 PNI 的治療方法主要分為非手術治療和手術治療，但目前所有的治療方法都有一定的局限性，在臨床上應根據患者個體情況選擇最合適的治療方法。
目前 PNI 的非手術治療主要包括電刺激、磁刺激和激光光療等[25-27]，適用于不太嚴重的 PNI。雖然以上方法在實驗動物模型中均取得可喜的結果，但關于非手術治療在人體中應用的研究較為有限，且療效也尚存爭議。
在手術治療上，神經移植是目前最主要的方法，具體包括同種自體神經移植、同種異體神經移植、神經移位、神經導管等[28]。對于長距離的 PNI，自體神經移植依然是治療的金標準。但因自體神經移植存在供體神經數量有限，會造成新的神經損傷及神經瘤的形成等缺陷而限制了其臨床應用，因此同種異體神經移植成為了新興的移植選擇[29]，但同種異體移植后的免疫排斥反應也成為了神經移植治療的主要難題。
近年來關于使用神經導管治療 PNI 的研究不斷增加，學者們使用各種天然或人工合成材料制作神經導管并期待它們能成為最有發展前景的治療手段，人工合成的可降解材料包括聚乳酸、聚己內酯、聚乙醇酸等，可用的天然高分子材料則包括殼聚糖、膠原、明膠、透明質酸及絲素蛋白等[30]。這些材料在神經再生治療上有獨到的優勢，如良好的生物相容性、較低的免疫原性等。但同時也需要關注材料本身的特性，如溶解性、降解度、機械強度等生物體本身造成的影響，從而避免在術后對再生神經造成二次損傷。另外，由于這些材料缺乏組織特異性及再生相關線索而導致實際應用有限。
相比之下，dECM 因其保留了大部分生物固有成分及天然的超微結構吸引了多數再生醫學研究者的關注[13-14]，同時其因可有效解決同種異體移植的免疫排斥問題而成為再生醫學領域在治療 PNI 方面極具潛力的生物材料。
2 dECM
dECM 近年來逐漸成為再生醫學領域的研究重點。研究者們利用各種方法將生物組織中的細胞除去，并盡可能地保留細胞外基質，再以此作為再生細胞的骨架，將其植入神經損傷部位，以提供神經斷端再接的橋梁。目前常用于修復 PNI 的組織為坐骨神經[31]，亦有研究者嘗試以膀胱組織制備 dECM 以治療 PNI[32]。下文將介紹幾種常用的制備 dECM 的方法及其在 PNI 中的應用。
2.1 dECM 制備
2.1.1 物理方法
冷凍保存及凍融循環是目前常見的物理脫細胞方法，其原理為利用低溫降低移植物組織的免疫原性，并使細胞內冰晶形成破壞細胞膜，達到脫細胞的目的。Evans 等[33]將大鼠坐骨神經移植段置于 5℃的冷藏液中保存 1～26 周，或反復冷凍（?40℃）和解凍（20℃）進行預處理。經過處理后，周圍神經的施萬細胞基底膜和層粘連蛋白的分布保持不變，而且保存 3 周后依然能檢測到一些活細胞。Kaizawa 等[34]則將大鼠坐骨神經放入液氮中冷凍，直到達到熱平衡，然后將其置于室溫的磷酸鹽緩沖鹽水中 2 min。此冷凍和解凍循環重復 3 次。隨后的體內實驗結果表明 dECM 移植組與自體神經移植組移植部位觀察到的 CD8+細胞數量無顯著差異，而與同種異體神經移植組有顯著差異，說明凍融循環可以有效降低同種異體組織的免疫原性。
其他物理脫細胞方法還包括高滲/低滲液體滲透壓破裂法[35]、非熱不可逆電穿孔法[36]、封閉式超聲法[37]等，但這些物理脫細胞方法在神經組織上的應用效果還有待進一步研究。
2.1.2 化學法及酶法
除物理方法外，化學法及酶法常聯合在一起用于達成脫細胞的目的。其原理為使用洗滌劑破壞細胞膜結構，聯合生物酶等進一步降解細胞成分，從而完成脫細胞制備。目前常用的洗滌劑包括：① 離子型洗滌劑：十二烷基硫酸鈉、脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate, SDC）、triton X-200 等；② 非離子型洗滌劑：triton X-100；③ 兩性洗滌劑：磺胺甜菜堿-10、磺胺甜菜堿-16、CHAPS；④ 酸和堿：鹽酸、氫氧化鈉等。常用的生物酶包括：① 核酸酶：DNA 酶、RNA 酶；② 蛋白酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶。
Sondell 等[38]最先開始嘗試使用化學試劑制備大鼠坐骨神經的 dECM，他們清除外部碎屑后，將分離的坐骨神經浸入蒸餾水中，在室溫下保存 7 h，期間多次更換蒸餾水。然后將神經放入在含 3% triton X-100 的蒸餾水中過夜，隨后將神經取出，放入含 4% SDC 的蒸餾水中攪拌 24 h。然后重復 1 次以上提取程序，用水清洗后即可使用。體外評估（包括形態學、免疫組化、電子顯微鏡等）顯示脫細胞效果良好，其體內實驗結果顯示軸突能以 1.2 mm/d 的速度在 dECM 中生長。
最近 Bae 等[39]嘗試使用兩性洗滌劑聯合核酸酶進行對人正中神經及腓腸神經進行脫細胞操作。具體步驟為：將神經片段用 100 mM CHAPS 在磷酸鹽緩沖液中處理 1 d。然后將神經片段轉移到 1M 氯化鈉溶液中 15 h。清洗后，將神經片段置于脫氧核糖核酸酶 I 和核糖核酸酶 A 中 37℃作用 24 h，然后每 12 小時更換 1 次磷酸鹽緩沖液，洗滌剩余試劑 72 h。樣品脫細胞后保存在磷酸鹽緩沖液中，溫度為 4℃。脫細胞后即刻進行組織學分析和 DNA 定量。他們同時對比了使用 triton X-100 和 SDC 脫細胞的效果，結果顯示使用兩性洗滌劑和核酸酶的脫細胞效果（包括脫細胞程度、細胞外基質完整性、膠原保留量、DNA 清除率等）要優于使用 triton X-100 和 SDC。
2.1.3 誘導細胞凋亡法
誘導細胞凋亡后再洗脫細胞殘留物制備 dECM 最先由 Bourgine 等[40]提出，其利用細胞凋亡的內源性和外源性啟動程序及凋亡環境調控設計了一套脫細胞體系。Cornelison 等[41]則發現利用小分子細胞毒素（喜樹堿）可誘導大鼠周圍神經凋亡，配合高滲溶液及 DNA 酶的使用完成 dECM 的制備，將其移植入大鼠皮下后顯示出比陰性對照組更低的免疫原性，證明了細胞凋亡是制備 dECM 的有效方法。目前誘導細胞凋亡制備 dECM 的相關報道仍較為有限，更多的誘導凋亡方法有待進一步研究提出并驗證。
2.2 dECM 治療 PNI
2.2.1 dECM 對施萬細胞及軸突生長的影響
在正常的生物體中，細胞外基質的結構與成分并不是一成不變的，它與周圍細胞不斷發生相互作用，在特定的組織中與特定的細胞在各種生物酶或其他因素的影響下發生物理和生化特性的改變，以形成特定組織的機械或生化特性，如拉伸、壓縮強度和彈性等[42]。周圍神經細胞外基質的主要成分為膠原蛋白、糖胺聚糖、纖連蛋白、層粘連蛋白等，這些成分對施萬細胞和軸突的行為有著重要的影響。在 PNI 后，施萬細胞是神經修復的主要效應細胞。施萬細胞膜上的整合素分子通過改變自身α和β亞基構象與細胞外基質蛋白結合激活黏著斑激酶，經過一連串的磷酸化反應后激活負責細胞生長和分化的特定基因的轉錄和調節[43]。層粘連蛋白在軸突的延長中也有關鍵作用，既往與現在的研究證明層粘連蛋白的存在可激活施萬細胞相關信號通路并幫助軸突延長[44]。
在細胞外基質中，一些生長因子與特定的細胞外基質蛋白具有很高的親和力，例如腦源性神經營養因子、睫狀神經營養因子、成纖維細胞生長因子、膠質細胞源性神經營養因子、神經生長因子（nerve growth factor, NGF）、神經營養因子-3 等[45]，如 NGF 可激活神經營養蛋白受體 p75/AMP 活化蛋白激酶/mTOR 途徑以加速施萬細胞在沃勒式變性中髓鞘的降解和碎片清除[46]，同時如上文所述，mTOR 的激活與損傷信號分子的表達上調相關，神經元胞體在接受到損傷信號后上調再生相關基因的表達[21]，在施萬細胞的參與下完成軸突的延長再生。
2.2.2 dECM 在 PNI 動物模型中的治療效果
dECM 作為一種新型的生物材料具有較強的可塑性，目前在 PNI 修復的研究報道中常將 dECM 的用途分為兩大類：一類是制作 dECM 水凝膠[47]。制成水凝膠時常需要聯合其他材料作為支撐，如在神經導管中填充 dECM 水凝膠以提供施萬細胞及軸突的生長線索。另一類是制作生物支架，包括傳統支架、靜電紡絲支架和 3D 打印支架。傳統支架即單純的 dECM，周圍神經經過脫細胞后直接用作生物支架進行移植；靜電紡絲支架常用聚己內酯制備，為了提高支架性能，研究者們將 dECM 加入其中，使其膠原蛋白含量及糖胺聚糖含量提高[48]；在 3D 打印領域，以 dECM 為基礎的生物墨水因其良好的生物相容性逐漸引起人們的關注[49]，且研究發現在3D 打印的聚己內酯導管中利用聚多巴胺作為粘合劑可有效提高 dECM 與聚己內酯的結合強度，防止其脫離[50]。
① dECM 水凝膠填充神經導管治療 PNI：dECM 水凝膠是 dECM 最常用的形式，Lin 等[47]將小型豬坐骨神經脫細胞后研磨成粉末，再利用胃蛋白酶溶解消化，經過離心后除去未溶解顆粒，將溶液冷凍干燥，隨后經過乙醇脫脂、堿中和、磷酸鹽緩沖液調整離子強度后，將所得預凝膠溶液置于 37℃環境中一段時間即可孵化形成 dECM 水凝膠。將 dECM 水凝膠灌入神經導管中后移植入大鼠坐骨神經損傷模型中（損傷長度為 15 mm），其結果顯示 dECM 水凝膠免疫原性較低，并有減輕促炎反應、促進基質重塑的作用。移植后 2 周的免疫熒光分析發現實驗組軸突的再生長度為 6 mm，電生理評價中其神經傳導速度為 20 m/s，均約為對照組的 2 倍，證明 dECM 水凝膠具有良好的生物相容性和促神經再生作用。Meder 等[31]則利用相似的方法修復坐骨神經損傷長度為 8 mm 的大鼠模型，經過 24 周的步態分析后，結果顯示實驗組的運動功能較對照組有明顯的改善，同時再生軸突的定量分析中也顯示實驗組的末端軸突數量顯著高于對照組。
② dECM 結合生長因子治療 PNI：動物組織經過脫細胞后的細胞外基質都會有一定程度的成分損失，其中包括 NGF、腦源性神經營養因子等[51]，這些營養因子經研究證明與 PNI 的修復密切相關[52]。Boyer 等[53]在體外實驗的結果表明在添加有 NGF 和膠質細胞源性神經營養因子的培養基中從背根神經節生長出的軸突密度和軸突長度顯著高于對照組，且隨后的體內實驗表明，在大鼠坐骨神經損傷模型中移植整合以上 2 種生長因子的 dECM 支架中，含有 NGF 的脫細胞支架顯著促進了軸突的生長。
由于嚙齒動物的坐骨神經損傷模型在神經的粗細、軸突長度及天然的再生速度方面與人類存在差異，研究人員嘗試使用更大型的動物損傷模型模擬人類 PNI 的情況。Qiu 等[54]將整合了膠質細胞源性神經營養因子的 dECM 水凝膠移植入比格犬的損傷坐骨神經（損傷長度 50 mm）中，移植后的實驗動物均未出現明顯嚴重的炎癥或感染，術后 1～6 個月后肢步態逐漸改善，在復合肌肉動作電位振幅、神經傳導速度的評估結果均顯著優于對照組，對再生軸突進行組織學觀察和形態計量分析發現，實驗組的再髓鞘化軸突數量、再髓鞘化軸突直徑及髓鞘厚度也均顯著優于對照組，以上結果證明了利用生長因子修飾 dECM 以修復 PNI 是具有潛力的方法。
③ dECM 結合干細胞種植治療 PNI：由于近年來細胞治療的興起，干細胞治療 PNI 也受到許多學者的重視。許多動物研究證明了干細胞在周圍神經損失的修復中有積極作用[55]。Mathot 等[56]通過基因譜分析的方法證實無論是分化的還是未分化的脂肪源性干細胞，在與大鼠的坐骨神經 dECM 相互作用后，其神經營養基因（NGF、GDNF、GAP43、PMP22）、血管生成基因（VEGF1）、細胞外基質基因（FBLN1、LAMB2）和細胞周期調控基因（CASP3、CCNB2）等基因的表達均會增強，表明周圍神經來源的 dECM 有引導干細胞功能分化以促進神經修復的能力。
Zhou 等[57]將脂肪源性干細胞及骨髓源性干細胞植入化學處理的同種異體 dECM 后移植入大鼠坐骨神經損傷模型中（損傷長度 10 mm）并對比 2 種干細胞在 PNI 修復中的效果，其結果顯示無論是損傷大鼠的運動功能評分（坐骨神經功能指數），還是電生理評價（肌肉動作電位幅度、運動神經傳導速度）均無明顯差異，且 2 種干細胞的修復效果均顯著優于無干細胞組，但劣于自體神經移植組。因此，在 2 種干細胞的治療效果無顯著差異的情況下，更易獲得且增殖速度更快的脂肪源性干細胞是治療 PNI 更具前景的干細胞來源[57]。
④ 新型 dECM 治療 PNI：在認識到 dECM 在 PNI 治療中的重要地位后，研究者試圖開發出更多新型的 dECM 應用方法。Li 等[58]利用豬坐骨神經脫細胞后得到 dECM，將其冷凍干燥后碎成粉末，利用冰醋酸將其溶解消化后轉移至平板上制成神經修復薄膜，這種薄膜利用在進行端-端吻合的周圍神經神經損傷中可有效防止吻合口處與周圍組織的粘連，同時 dECM 成分可促進神經再生速度。
術后傷口是否出現感染是手術預后的重要決定因素[59]，Kong 等[60]將豬坐骨神經 dECM 制備成水凝膠后與殼聚糖按 1∶2、1∶1、2∶1 這 3 種比例混合后制備成具有抗菌能力的神經 dECM-殼聚糖支架，其體外實驗結果證明神經 dECM-殼聚糖對大腸桿菌的菌落生長抑制率高達 90%，對金黃色葡萄球菌的菌落生長抑制率為 80%，且該特性不會隨著殼聚糖的濃度降低而降低。同時，神經 dECM-殼聚糖中 dECM 含量越高，其施萬細胞生長速度及遷移速度越快，更有利于周圍神經的再生。
對于由擠壓造成的神經損傷，在神經外膜沒有破裂的情況下，Prest 等[61]制備出一種可注射型的神經特異性 dECM，他們將其用注入坐骨神經損傷大鼠的損傷側及未損傷側的神經外膜下間隙，后期的檢測結果發現使用了該水凝膠可輕微改善大鼠運動學（坐骨神經功能指數、電生理評估等）及組織學（再生軸突數量、肌纖維數量等）結果，且不會對損傷的神經斷端造成二次損傷。
3 總結與展望
PNI 的再生與修復一直是困擾眾多外科醫生的難題，保守治療方法如電刺激、磁刺激及激光光療等對輕癥的 PNI 有一定治療效果，但臨床應用上仍需深入探索。自體神經移植作為治療嚴重或長距離 PNI 的金標準，卻存在供體神經數量有限、會造成新的神經損傷和神經瘤形成等問題而未廣泛用于臨床。dECM 移植物因有望代替自體神經而受到多數再生醫學研究者的關注，其結合神經導管、生長因子、干細胞種植及其他新型用途在動物模型上取得較好的結果，但因實驗動物與人類的神經存在物種差異，dECM 在人體臨床應用上的推廣還有待后續進一步研究。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
周圍神經損傷（peripheral nerve injury, PNI）是一種常見的神經功能障礙，可能由多種因素引起，包括牽拉、擠壓、切割、手術麻醉等[1]。其可能導致感覺喪失、運動功能障礙甚至殘疾[2]。傳統的治療方法如自體神經移植存在供體部位損傷和有限供應等問題，因此尋找新的治療策略尤為重要[3]。脫細胞基質（decellularized extracellular matrix, dECM）水凝膠因其獨特的生物相容性、生物活性、可塑性和降解性，在組織工程和再生醫學領域受到了廣泛關注[4-5]。在國際上，dECM 水凝膠已被廣泛研究用于多種組織工程，如皮膚、骨與軟骨、腎臟、心臟、肝臟等[6-14]。許多研究表明，dECM 水凝膠能夠提供物理支持和生物化學信號，促進神經細胞的增殖和分化，加速神經再生過程[15-16]。本文綜述了當前 dECM 水凝膠在治療 PNI 方面的研究進展，包含 PNI 的背景介紹和 dECM 的制備、dECM 治療 PNI、dECM 對施萬細胞及軸突生長的影響和 dECM 在 PNI 動物模型中的治療效果等內容。
1 PNI 概述
1.1 PNI 及其再生
當發生 PNI 時，遠側斷端細胞骨架及細胞膜崩解，施萬細胞去髓鞘化，轉變為增殖細胞，與巨噬細胞一同清除損傷處周圍的細胞碎片，同時施萬細胞增殖、相互融合，形成 Bungner 帶，為軸突的再生及遠端橋接創造條件，此過程為沃勒變性[17]。在損傷近端斷端則形成生長錐，作為再生軸突的前體，它會沿著 Bungner 管延伸并重新與遠端靶器官形成再神經支配[18]。
1.2 軸突損傷的信號傳導
當 PNI 發生后，相關損傷信號會通過幾個信號傳導通路逆行傳送至細胞核[19]，其中關鍵步驟是由輸入蛋白、信號轉導及轉錄激活蛋白 3 及其他蛋白質形成的逆行損傷信號分子復合體完成[20]。為快速響應軸突再生過程，輸入蛋白、信號轉導及轉錄激活蛋白 3 必須在軸突損傷處局部翻譯，該過程與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）的局部上調相關。在大鼠坐骨損傷模型中 mTOR 在損傷軸突的含量在損傷后 3 h 內顯著升高，使用 mTOR 抑制劑 torin-1 可明顯減少損傷神經元的損傷信號分子的局部上調[21]，導致損傷后再生的神經元數量減少。胞體在接收到相關損傷逆行信號后進行整合，并上調再生相關基因以修復受損軸突[22]。
1.3 肌肉失神經萎縮
肌肉的失神經萎縮是一個慢性過程，最主要的變化是肌肉收縮功能的降低和肌肉纖維數量的減少等[23]。但即使是神經再連接的肌肉組織，其運動功能也不能完全恢復，這個結果被認為與神經-肌肉連接的再生有關，相關研究表明即使軸突成功再生，其與肌肉組織的突觸連接再生失敗也會導致運動功能的喪失[24]。所以在治療中應重視失神經后的靶器官保護，而在長期失神經萎縮的肌肉組織中，骨骼肌干細胞仍然保留著再生潛力，這讓肌肉失神經后運動功能的恢復成為可能。
1.4 PNI 的治療方法
PNI 的治療原則是恢復神經斷端的連接，并使其支配的肌肉恢復運動功能，目前對于 PNI 的治療方法主要分為非手術治療和手術治療，但目前所有的治療方法都有一定的局限性，在臨床上應根據患者個體情況選擇最合適的治療方法。
目前 PNI 的非手術治療主要包括電刺激、磁刺激和激光光療等[25-27]，適用于不太嚴重的 PNI。雖然以上方法在實驗動物模型中均取得可喜的結果，但關于非手術治療在人體中應用的研究較為有限，且療效也尚存爭議。
在手術治療上，神經移植是目前最主要的方法，具體包括同種自體神經移植、同種異體神經移植、神經移位、神經導管等[28]。對于長距離的 PNI，自體神經移植依然是治療的金標準。但因自體神經移植存在供體神經數量有限，會造成新的神經損傷及神經瘤的形成等缺陷而限制了其臨床應用，因此同種異體神經移植成為了新興的移植選擇[29]，但同種異體移植后的免疫排斥反應也成為了神經移植治療的主要難題。
近年來關于使用神經導管治療 PNI 的研究不斷增加，學者們使用各種天然或人工合成材料制作神經導管并期待它們能成為最有發展前景的治療手段，人工合成的可降解材料包括聚乳酸、聚己內酯、聚乙醇酸等，可用的天然高分子材料則包括殼聚糖、膠原、明膠、透明質酸及絲素蛋白等[30]。這些材料在神經再生治療上有獨到的優勢，如良好的生物相容性、較低的免疫原性等。但同時也需要關注材料本身的特性，如溶解性、降解度、機械強度等生物體本身造成的影響，從而避免在術后對再生神經造成二次損傷。另外，由于這些材料缺乏組織特異性及再生相關線索而導致實際應用有限。
相比之下，dECM 因其保留了大部分生物固有成分及天然的超微結構吸引了多數再生醫學研究者的關注[13-14]，同時其因可有效解決同種異體移植的免疫排斥問題而成為再生醫學領域在治療 PNI 方面極具潛力的生物材料。
2 dECM
dECM 近年來逐漸成為再生醫學領域的研究重點。研究者們利用各種方法將生物組織中的細胞除去，并盡可能地保留細胞外基質，再以此作為再生細胞的骨架，將其植入神經損傷部位，以提供神經斷端再接的橋梁。目前常用于修復 PNI 的組織為坐骨神經[31]，亦有研究者嘗試以膀胱組織制備 dECM 以治療 PNI[32]。下文將介紹幾種常用的制備 dECM 的方法及其在 PNI 中的應用。
2.1 dECM 制備
2.1.1 物理方法
冷凍保存及凍融循環是目前常見的物理脫細胞方法，其原理為利用低溫降低移植物組織的免疫原性，并使細胞內冰晶形成破壞細胞膜，達到脫細胞的目的。Evans 等[33]將大鼠坐骨神經移植段置于 5℃的冷藏液中保存 1～26 周，或反復冷凍（?40℃）和解凍（20℃）進行預處理。經過處理后，周圍神經的施萬細胞基底膜和層粘連蛋白的分布保持不變，而且保存 3 周后依然能檢測到一些活細胞。Kaizawa 等[34]則將大鼠坐骨神經放入液氮中冷凍，直到達到熱平衡，然后將其置于室溫的磷酸鹽緩沖鹽水中 2 min。此冷凍和解凍循環重復 3 次。隨后的體內實驗結果表明 dECM 移植組與自體神經移植組移植部位觀察到的 CD8+細胞數量無顯著差異，而與同種異體神經移植組有顯著差異，說明凍融循環可以有效降低同種異體組織的免疫原性。
其他物理脫細胞方法還包括高滲/低滲液體滲透壓破裂法[35]、非熱不可逆電穿孔法[36]、封閉式超聲法[37]等，但這些物理脫細胞方法在神經組織上的應用效果還有待進一步研究。
2.1.2 化學法及酶法
除物理方法外，化學法及酶法常聯合在一起用于達成脫細胞的目的。其原理為使用洗滌劑破壞細胞膜結構，聯合生物酶等進一步降解細胞成分，從而完成脫細胞制備。目前常用的洗滌劑包括：① 離子型洗滌劑：十二烷基硫酸鈉、脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate, SDC）、triton X-200 等；② 非離子型洗滌劑：triton X-100；③ 兩性洗滌劑：磺胺甜菜堿-10、磺胺甜菜堿-16、CHAPS；④ 酸和堿：鹽酸、氫氧化鈉等。常用的生物酶包括：① 核酸酶：DNA 酶、RNA 酶；② 蛋白酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶。
Sondell 等[38]最先開始嘗試使用化學試劑制備大鼠坐骨神經的 dECM，他們清除外部碎屑后，將分離的坐骨神經浸入蒸餾水中，在室溫下保存 7 h，期間多次更換蒸餾水。然后將神經放入在含 3% triton X-100 的蒸餾水中過夜，隨后將神經取出，放入含 4% SDC 的蒸餾水中攪拌 24 h。然后重復 1 次以上提取程序，用水清洗后即可使用。體外評估（包括形態學、免疫組化、電子顯微鏡等）顯示脫細胞效果良好，其體內實驗結果顯示軸突能以 1.2 mm/d 的速度在 dECM 中生長。
最近 Bae 等[39]嘗試使用兩性洗滌劑聯合核酸酶進行對人正中神經及腓腸神經進行脫細胞操作。具體步驟為：將神經片段用 100 mM CHAPS 在磷酸鹽緩沖液中處理 1 d。然后將神經片段轉移到 1M 氯化鈉溶液中 15 h。清洗后，將神經片段置于脫氧核糖核酸酶 I 和核糖核酸酶 A 中 37℃作用 24 h，然后每 12 小時更換 1 次磷酸鹽緩沖液，洗滌剩余試劑 72 h。樣品脫細胞后保存在磷酸鹽緩沖液中，溫度為 4℃。脫細胞后即刻進行組織學分析和 DNA 定量。他們同時對比了使用 triton X-100 和 SDC 脫細胞的效果，結果顯示使用兩性洗滌劑和核酸酶的脫細胞效果（包括脫細胞程度、細胞外基質完整性、膠原保留量、DNA 清除率等）要優于使用 triton X-100 和 SDC。
2.1.3 誘導細胞凋亡法
誘導細胞凋亡后再洗脫細胞殘留物制備 dECM 最先由 Bourgine 等[40]提出，其利用細胞凋亡的內源性和外源性啟動程序及凋亡環境調控設計了一套脫細胞體系。Cornelison 等[41]則發現利用小分子細胞毒素（喜樹堿）可誘導大鼠周圍神經凋亡，配合高滲溶液及 DNA 酶的使用完成 dECM 的制備，將其移植入大鼠皮下后顯示出比陰性對照組更低的免疫原性，證明了細胞凋亡是制備 dECM 的有效方法。目前誘導細胞凋亡制備 dECM 的相關報道仍較為有限，更多的誘導凋亡方法有待進一步研究提出并驗證。
2.2 dECM 治療 PNI
2.2.1 dECM 對施萬細胞及軸突生長的影響
在正常的生物體中，細胞外基質的結構與成分并不是一成不變的，它與周圍細胞不斷發生相互作用，在特定的組織中與特定的細胞在各種生物酶或其他因素的影響下發生物理和生化特性的改變，以形成特定組織的機械或生化特性，如拉伸、壓縮強度和彈性等[42]。周圍神經細胞外基質的主要成分為膠原蛋白、糖胺聚糖、纖連蛋白、層粘連蛋白等，這些成分對施萬細胞和軸突的行為有著重要的影響。在 PNI 后，施萬細胞是神經修復的主要效應細胞。施萬細胞膜上的整合素分子通過改變自身α和β亞基構象與細胞外基質蛋白結合激活黏著斑激酶，經過一連串的磷酸化反應后激活負責細胞生長和分化的特定基因的轉錄和調節[43]。層粘連蛋白在軸突的延長中也有關鍵作用，既往與現在的研究證明層粘連蛋白的存在可激活施萬細胞相關信號通路并幫助軸突延長[44]。
在細胞外基質中，一些生長因子與特定的細胞外基質蛋白具有很高的親和力，例如腦源性神經營養因子、睫狀神經營養因子、成纖維細胞生長因子、膠質細胞源性神經營養因子、神經生長因子（nerve growth factor, NGF）、神經營養因子-3 等[45]，如 NGF 可激活神經營養蛋白受體 p75/AMP 活化蛋白激酶/mTOR 途徑以加速施萬細胞在沃勒式變性中髓鞘的降解和碎片清除[46]，同時如上文所述，mTOR 的激活與損傷信號分子的表達上調相關，神經元胞體在接受到損傷信號后上調再生相關基因的表達[21]，在施萬細胞的參與下完成軸突的延長再生。
2.2.2 dECM 在 PNI 動物模型中的治療效果
dECM 作為一種新型的生物材料具有較強的可塑性，目前在 PNI 修復的研究報道中常將 dECM 的用途分為兩大類：一類是制作 dECM 水凝膠[47]。制成水凝膠時常需要聯合其他材料作為支撐，如在神經導管中填充 dECM 水凝膠以提供施萬細胞及軸突的生長線索。另一類是制作生物支架，包括傳統支架、靜電紡絲支架和 3D 打印支架。傳統支架即單純的 dECM，周圍神經經過脫細胞后直接用作生物支架進行移植；靜電紡絲支架常用聚己內酯制備，為了提高支架性能，研究者們將 dECM 加入其中，使其膠原蛋白含量及糖胺聚糖含量提高[48]；在 3D 打印領域，以 dECM 為基礎的生物墨水因其良好的生物相容性逐漸引起人們的關注[49]，且研究發現在3D 打印的聚己內酯導管中利用聚多巴胺作為粘合劑可有效提高 dECM 與聚己內酯的結合強度，防止其脫離[50]。
① dECM 水凝膠填充神經導管治療 PNI：dECM 水凝膠是 dECM 最常用的形式，Lin 等[47]將小型豬坐骨神經脫細胞后研磨成粉末，再利用胃蛋白酶溶解消化，經過離心后除去未溶解顆粒，將溶液冷凍干燥，隨后經過乙醇脫脂、堿中和、磷酸鹽緩沖液調整離子強度后，將所得預凝膠溶液置于 37℃環境中一段時間即可孵化形成 dECM 水凝膠。將 dECM 水凝膠灌入神經導管中后移植入大鼠坐骨神經損傷模型中（損傷長度為 15 mm），其結果顯示 dECM 水凝膠免疫原性較低，并有減輕促炎反應、促進基質重塑的作用。移植后 2 周的免疫熒光分析發現實驗組軸突的再生長度為 6 mm，電生理評價中其神經傳導速度為 20 m/s，均約為對照組的 2 倍，證明 dECM 水凝膠具有良好的生物相容性和促神經再生作用。Meder 等[31]則利用相似的方法修復坐骨神經損傷長度為 8 mm 的大鼠模型，經過 24 周的步態分析后，結果顯示實驗組的運動功能較對照組有明顯的改善，同時再生軸突的定量分析中也顯示實驗組的末端軸突數量顯著高于對照組。
② dECM 結合生長因子治療 PNI：動物組織經過脫細胞后的細胞外基質都會有一定程度的成分損失，其中包括 NGF、腦源性神經營養因子等[51]，這些營養因子經研究證明與 PNI 的修復密切相關[52]。Boyer 等[53]在體外實驗的結果表明在添加有 NGF 和膠質細胞源性神經營養因子的培養基中從背根神經節生長出的軸突密度和軸突長度顯著高于對照組，且隨后的體內實驗表明，在大鼠坐骨神經損傷模型中移植整合以上 2 種生長因子的 dECM 支架中，含有 NGF 的脫細胞支架顯著促進了軸突的生長。
由于嚙齒動物的坐骨神經損傷模型在神經的粗細、軸突長度及天然的再生速度方面與人類存在差異，研究人員嘗試使用更大型的動物損傷模型模擬人類 PNI 的情況。Qiu 等[54]將整合了膠質細胞源性神經營養因子的 dECM 水凝膠移植入比格犬的損傷坐骨神經（損傷長度 50 mm）中，移植后的實驗動物均未出現明顯嚴重的炎癥或感染，術后 1～6 個月后肢步態逐漸改善，在復合肌肉動作電位振幅、神經傳導速度的評估結果均顯著優于對照組，對再生軸突進行組織學觀察和形態計量分析發現，實驗組的再髓鞘化軸突數量、再髓鞘化軸突直徑及髓鞘厚度也均顯著優于對照組，以上結果證明了利用生長因子修飾 dECM 以修復 PNI 是具有潛力的方法。
③ dECM 結合干細胞種植治療 PNI：由于近年來細胞治療的興起，干細胞治療 PNI 也受到許多學者的重視。許多動物研究證明了干細胞在周圍神經損失的修復中有積極作用[55]。Mathot 等[56]通過基因譜分析的方法證實無論是分化的還是未分化的脂肪源性干細胞，在與大鼠的坐骨神經 dECM 相互作用后，其神經營養基因（NGF、GDNF、GAP43、PMP22）、血管生成基因（VEGF1）、細胞外基質基因（FBLN1、LAMB2）和細胞周期調控基因（CASP3、CCNB2）等基因的表達均會增強，表明周圍神經來源的 dECM 有引導干細胞功能分化以促進神經修復的能力。
Zhou 等[57]將脂肪源性干細胞及骨髓源性干細胞植入化學處理的同種異體 dECM 后移植入大鼠坐骨神經損傷模型中（損傷長度 10 mm）并對比 2 種干細胞在 PNI 修復中的效果，其結果顯示無論是損傷大鼠的運動功能評分（坐骨神經功能指數），還是電生理評價（肌肉動作電位幅度、運動神經傳導速度）均無明顯差異，且 2 種干細胞的修復效果均顯著優于無干細胞組，但劣于自體神經移植組。因此，在 2 種干細胞的治療效果無顯著差異的情況下，更易獲得且增殖速度更快的脂肪源性干細胞是治療 PNI 更具前景的干細胞來源[57]。
④ 新型 dECM 治療 PNI：在認識到 dECM 在 PNI 治療中的重要地位后，研究者試圖開發出更多新型的 dECM 應用方法。Li 等[58]利用豬坐骨神經脫細胞后得到 dECM，將其冷凍干燥后碎成粉末，利用冰醋酸將其溶解消化后轉移至平板上制成神經修復薄膜，這種薄膜利用在進行端-端吻合的周圍神經神經損傷中可有效防止吻合口處與周圍組織的粘連，同時 dECM 成分可促進神經再生速度。
術后傷口是否出現感染是手術預后的重要決定因素[59]，Kong 等[60]將豬坐骨神經 dECM 制備成水凝膠后與殼聚糖按 1∶2、1∶1、2∶1 這 3 種比例混合后制備成具有抗菌能力的神經 dECM-殼聚糖支架，其體外實驗結果證明神經 dECM-殼聚糖對大腸桿菌的菌落生長抑制率高達 90%，對金黃色葡萄球菌的菌落生長抑制率為 80%，且該特性不會隨著殼聚糖的濃度降低而降低。同時，神經 dECM-殼聚糖中 dECM 含量越高，其施萬細胞生長速度及遷移速度越快，更有利于周圍神經的再生。
對于由擠壓造成的神經損傷，在神經外膜沒有破裂的情況下，Prest 等[61]制備出一種可注射型的神經特異性 dECM，他們將其用注入坐骨神經損傷大鼠的損傷側及未損傷側的神經外膜下間隙，后期的檢測結果發現使用了該水凝膠可輕微改善大鼠運動學（坐骨神經功能指數、電生理評估等）及組織學（再生軸突數量、肌纖維數量等）結果，且不會對損傷的神經斷端造成二次損傷。
3 總結與展望
PNI 的再生與修復一直是困擾眾多外科醫生的難題，保守治療方法如電刺激、磁刺激及激光光療等對輕癥的 PNI 有一定治療效果，但臨床應用上仍需深入探索。自體神經移植作為治療嚴重或長距離 PNI 的金標準，卻存在供體神經數量有限、會造成新的神經損傷和神經瘤形成等問題而未廣泛用于臨床。dECM 移植物因有望代替自體神經而受到多數再生醫學研究者的關注，其結合神經導管、生長因子、干細胞種植及其他新型用途在動物模型上取得較好的結果，但因實驗動物與人類的神經存在物種差異，dECM 在人體臨床應用上的推廣還有待后續進一步研究。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。