引用本文： 李遠志, 任玥晗, 方志遠. 乳腺癌與肩袖損傷：一項兩樣本雙向孟德爾隨機化研究. 華西醫學, 2024, 39(11): 1744-1752. doi: 10.7507/1002-0179.202405004 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《華西醫學》版權所有，未經授權不得轉載、改編
肩袖損傷是成人最常見的肌肉骨骼疾病之一[1]。研究表明，60 歲以上的人群中會有超過 30%的人出現肩袖撕裂[2]，其特征是肩袖肌群嚴重的炎癥、萎縮纖維化和脂肪浸潤，導致肩袖相關肌肉的不可逆性和持續性退化[3]，其發病原因包括遺傳、吸煙、性激素水平等因素[4]。乳腺癌是臨床上最常見的女性惡性腫瘤之一[5]，多達 91%的乳腺癌患者會出現肩部疾病，如無力、活動受限、僵硬和疼痛[6]。不僅如此，乳腺癌手術治療可能會對肩部肌肉的大小和運動產生負面影響[7-8]，甚至整個肩袖肌群也會表現出不同程度的損傷[9]。許多研究也從肩關節肌肉骨骼的解剖變化、術后并發癥、年齡等因素證實了乳腺癌患者肩關節損傷的病理基礎[10-12]。
孟德爾隨機化（Mendelian randomization, MR）是一種復雜的流行病學技術，通過模擬隨機臨床試驗中參與者的隨機分配，使用種系遺傳變異作為工具變量（instrumental variables, IV），也稱為單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism, SNP），來評估危險因素和疾病之間的因果關系[13]。而在傳統的流行病學研究中，由于混雜因素和反向因果關系的影響，得到的因果推論被認為價值有限[14]。MR 采用遺傳變異作為工具變量，從而規避了混雜因素和反向因果關系的影響[15]。所以，當缺乏臨床隨機對照試驗時，MR 研究是建立因果推斷的重要方法。基于此，本研究設計并完成了一項雙向 MR 分析，旨在探討乳腺癌與肩袖損傷之間的因果關系，為全面理解乳腺癌的具體發病機制提供基礎及為乳腺癌患者提供更好的預防和治療策略。
1 資料與方法
1.1 研究設計
本研究利用全基因組關聯研究（genome-wide association study, GWAS）的匯總統計數據，通過雙向 MR 方法對乳腺癌和肩袖損傷進行因果關聯分析。其中，正向研究是以乳腺癌為暴露因素，以肩袖損傷為結局變量；反向研究則是以肩袖損傷為暴露因素，乳腺癌為結局變量。在本研究中，乳腺癌和肩袖損傷之間的雙向 MR 滿足以下 3 個基本假設：① 相關性假設：遺傳變異與暴露密切相關；② 獨立性假設：遺傳變異與暴露和結局的混雜因素無關；③ 排他性假設：遺傳變異僅通過選定的暴露來影響結局[16]。
1.2 數據來源
乳腺癌的 GWAS 數據來自布里斯托大學的 MRC 綜合流行病學部門于 2017 年開展的一項對 106 776 例歐洲女性的研究（61 282 例乳腺癌病例和 47 494 例對照），受試者來自乳腺癌協會聯盟發現及合作的 68 項研究，約 10 680 257 個 SNP 位點[17]。肩袖損傷的 GWAS 數據來從歐洲生物信息學研究所于 2020 年的一項對 412 011 例歐洲人群的研究，其中包括 5 701 例肩袖損傷患者和 406 310 例具有歐洲血統的對照組，約 16 110 542 個 SNP 位點[18]。文章中使用的 GWAS 數據來源于公共數據庫，均得到了各自機構的倫理批準。GWAS 數據庫研究數據信息見表1。
表1
GWAS 數據庫研究數據信息
1.3 工具變量的篩選
1.3.1 正向 MR 分析
為了滿足相關性假設，本研究選擇了在全基因組范圍內與乳腺癌顯著相關（P<5×10?8）的 SNP，且為保證提取出的 IV 相互獨立，在 R 軟件中設置連鎖不平衡系數為 r2<0.001，連鎖不平衡區域寬度為 kb=10 000[19]。為排除潛在混雜因素或與結局相關的 SNP，使用了 PhenoScannerV2 網站用于交叉引用 IV，設置參數為：P<5×10?8，r2>0.8 以滿足獨立性假設與排他性假設[20]。接下來，合并暴露和結局 GWAS 數據，不在同一 DNA 鏈上測量的 SNP 以及具有中等等位基因頻率的回文 SNP 將被排除在外[21]。最后，計算每個剩余 SNP 的 F 統計量，以測量遺傳 IV 的強度，F≥10 時，表明存在弱工具變量偏倚的可能性較小[22]，F 統計量計算公式為：
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 |
其中，MAF 是次要等位基因頻率，β是給定 SNP 對暴露因子的遺傳效應，SE 是標準誤差，N 是暴露的樣本量，R2 為暴露數據庫中由 SNP 解釋的變異占比。
1.3.2 反向 MR 分析
根據之前的研究[23]，本研究用P<5×10?7 去篩選工具變量來獲取與暴露相關的 SNP，其余設置與正向 MR 相同的篩選閾值以獲取在全基因組范圍內與肩袖損傷顯著相關且不存在連鎖不平衡聚集的 SNP，以滿足相關性假設，檢索 PhenoScannerV2 網站（設置參數為：P<5×10?8，r2>0.8），排除與乳腺癌直接相關的 SNP，以滿足獨立性假設。最后，通過排除與乳腺癌在全基因組范圍內顯著相關的 SNP 以滿足排他性假設。此外，合并暴露和結局 GWAS 數據，排除不在同一 DNA 鏈上測量的 SNP及具有中等等位基因頻率的回文 SNP 。
1.4 統計學方法
在 R 編程環境（4.2.3 版）中使用“TwoSampleMR”包（版本 0.5.7）對納入數據進行統計分析。使用“MRPRESSO”軟件包（1.0 版）進行異常值識別。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，反之采用中位數（下四分位數，上四分位數）表示。計數資料采用例數和百分比表示。雙側檢驗水準α=0.05。
1.4.1 雙向 MR 分析
采用逆方差加權（inverse-variance weighted, IVW）法得到 MR 分析的主要結果[24]。為了補充 IVW，因此還采用了其他分析方法，作為對 IVW 分析結果的補充[25]，即 MR-Egger 法、加權中位數法、加權模型、簡單模型。如果以上 MR 方法估計的因果效應一致，則因果證據真實性的可信度將大大提高。但是，如果這些模型的因果效應估計不一致，則 IVW 方法的結果被視為主要結果[26]。上述結果以比值比（odds ratio, OR） 和 95% 置信區間（confidence interval, CI）表示。
1.4.2 敏感性分析
為了進一步檢驗研究結果的穩定性和可靠性，因此對結果進行敏感性分析、異質性檢驗、水平多效性檢驗。這些研究包括 Cochran Q 檢驗、MR-Egger 回歸法和留一法。通過 Cochran Q 檢驗的 IVW 模型的量化結果，可以確定是否存在潛在的異質性（P<0.05 表示存在異質性）[27]。MR-Egger 回歸中的截距是衡量水平多效性的可靠指標（P<0.05 表示存在多效性），用于判斷各個 SNP 之間是否存在水平多效性，如果截距＞0，說明存在水平多效性，即當沒有暴露因素干擾時，結局仍然存在[28]。此外，本研究還使用 MR-PRESSO 全局檢驗來識別離群值，進一步去除水平多效性，主要是通過去除顯著的異常值來降低水平多效性。如果 MR-PRESSO 全局檢驗的 P<0.05，說明存在離群值，應將其剔除并再次進行 MR 分析，即通過排除異常值以獲得更加接近真實值的估計值[29]。留一法則是每次逐個剔除 1 個 SNP 后，將剩余的 SNP 進行 MR 分析，判斷該 SNP 剔除前后是否存在統計學差異；若存在統計學差異，表明該 SNP 會對效應估計總結果產生影響；若不存在統計學差異，則表明上述 MR 結果穩健，故其被用于評估 MR 結果是否受單個 SNP 所影響[30]。
2 結果
2.1 乳腺癌對肩袖損傷風險的因果關系
2.1.1 工具變量的確定
共納入 61 個與乳腺癌相關且獨立的 SNP，在與肩袖損傷配對時丟失 3 個 SNP，未發現與潛在混雜因素相關的 SNP，去除 7 個回文 SNP（rs10978911、rs35910339、rs4076654、rs4286946、rs4979844、rs55674424、rs6904031），最終納入 51 個 SNP（表2）作為工具變量進行本次 MR。F 值的分布情況顯示，數據呈偏態分布，因此選擇使用中位數來描述其集中趨勢，F 值為 47.377（29.759，686.370），F 值均>10 表示納入的 SNP 與乳腺癌顯著相關，不存在偏倚，結果可靠。
表2
納入正向 MR 分析部分 SNP 信息
2.1.2 MR 分析
將保留的 51 個 SNP 與肩袖損傷結果協調對比，IVW［β=0.08，SE=0.03，OR=1.08，95%CI（1.02，1.12），P=0.014］表明乳腺癌可能作為肩袖損傷的危險因素，然而，其余 4 項檢驗均獲得了相反結果，且 P＞0.05（圖1）。乳腺癌對肩袖損傷風險的因果關系 MR 結果的散點圖和森林圖見圖2、3。可見，乳腺癌會增加患肩袖損傷的風險。
圖1
乳腺癌對肩袖損傷風險的因果關系 MR 結果森林圖
MR：孟德爾隨機化；Exposure：暴露；Methods：方法；MR Rgger：MR-Egger 法；Weighted median：加權中位數法；Inverse variance weighted：逆方差加權法；Simple mode：簡單模型法；Weighted mode：加權模型法；no.SNPs：單核苷酸多態性的數量；Breast cancer：乳腺癌；Rotator cuff injury：肩袖損傷
圖2
乳腺癌對肩袖損傷風險的因果關系 MR 結果的散點圖
橫坐標為單個 SNP 對暴露的效應，縱坐標為單個 SNP 對結局的效應，彩色線為暴露對結局的因果效應估計值擬合線；MR test：孟德爾隨機化方法；Inverse variance weighted：逆方差加權法；MR Egger：MR-Egger 法；Weighted median：加權中位數法；Weighted mode：加權模型法；Simple mode：簡單模型法；Breast cancer：乳腺癌；ieu-a-1129：乳腺癌數據集名稱；Rotator cuff injury：肩袖損傷：ebi-a-GCST90044700：肩袖損傷數據集名稱
圖3
乳腺癌對肩袖損傷風險的因果關系 MR 結果森林圖
黑點表示使用單個 SNP 估計暴露對結局風險的影響，黑線表示估計值的 95%CI；紅點表示使用 MR-Egger 和 IVW 估計暴露對結局風險的總體影響，紅線表示總體估計值的 95%CI。橫坐標為各個 SNP 估計暴露對結局的效應值；縱坐標為所有納入的 SNP；Breast cancer：乳腺癌；ieu-a-
2.1.3 敏感性分析
使用不同的方法進行 Cochran Q 檢驗來評估異質性，IVW（Cochran Q=41.372 93，P=0.80）和 MR Egger（Cochran Q=40.97，P=0.79）都表明工具變量之間沒有異質性；MR-Egger 回歸在本研究數據集中未顯示任何水平多效性效應的跡象（MR-Egger 截距=0.005，P=0.528）。乳腺癌與肩袖損傷風險的因果關系的漏斗圖和留一法分析森林圖見圖4、5。可見，沒有單個 SNP 嚴重違反整體效應。為了驗證早期的發現并識別任何異常值，本研究進行了 MR-PRESSO 檢驗，沒有發現異常值，無需考慮基因多效性對結果造成的影響。
圖4
乳腺癌與肩袖損傷風險的因果關系的漏斗圖
可見漏斗圖圖基本對稱。MR Method：孟德爾隨機化方法；
圖5
乳腺癌對肩袖損傷風險的因果關系留一法分析森林圖
黑點表示剔除此 SNP 后乳腺癌對肩袖損傷的因果效應估計，黑實線表示相應的 95%CI；紅點表示使用篩選過的 SNP 估計乳腺癌對肩袖損傷風險的整體因果效應，紅線表示合并估計相應的 95%CI。MR leave-one-out sensitivity analysis：孟德爾隨機化留一法敏感性分析； 橫坐標為剔除各個 SNP 估計乳腺癌對肩袖損傷的效應值；縱坐標為所有逐個剔除的 SNP；Breast cancer：乳腺癌；ieu-a-
2.2 肩袖損傷對乳腺癌風險的因果關系
2.2.1 工具變量的確定
共納入 4 個與肩袖損傷相關且獨立的 SNP，在與乳腺癌配對時丟失 1 個 SNP，未發現與潛在混雜因素相關及回文 SNP，最終納入 3 個 SNP（rs4772085、rs227752 和 rs4725069）作為工具變量進行本次 MR，F 值分別為 25.734、25.748、34.175，F 值均>10，表示納入的 SNP 與肩袖損傷顯著相關，不存在偏倚，結果可靠。
2.2.2 MR 分析
對 3 個 SNP 進行進一步分析，IVW［β=?0.05，SE=0.05，OR=0.95，95%CI（0.86，1.05），P=0.334］、加權中位數［β=?0.07，SE=0.06，OR=0.93，95%CI（0.83，1.05），P=0.252］、MR-Egger 法［β=?0.21，SE=0.33，OR=0.81，95%CI（0.43，1.53），P=0.632］、簡單模型［β=?0.10，SE=0.08，OR=0.90，95%CI（0.76，1.07），P=0.357］、加權模型法［β=?0.10，SE=0.07，OR=0.90，95%CI（0.76，1.07），P=0.350］均顯示高度相似性，表明支持肩袖損傷增加與發生乳腺癌風險之間存在顯著關聯的證據有限，見圖1。
2.2.3 敏感性分析
使用不同的方法進行 Cochran Q 檢驗來評估異質性，IVW 結果（Cochran Q=2.14，P=0.34）和 MR Egger（Cochran Q=1.70，P=0.19）都表明工具變量之間沒有異質性。肩袖損傷對乳腺癌風險的因果關系 MR 結果的散點圖、森林圖見圖6、7。可見，肩袖損傷會增加患乳腺癌風險的證據有限。
圖6
肩袖損傷對乳腺癌風險的因果關系 MR 結果的散點圖
橫坐標為單個 SNP 對暴露的效應，縱坐標為單個 SNP 對結局的效應，彩色線為暴露對結局的因果效應估計值擬合線；MR test：孟德爾隨機化方法；Inverse variance weighted：逆方差加權法；MR Egger：MR-Egger 法；Weighted median：加權中位數法；Weighted mode：加權模型法；Simple mode：簡單模型法；Breast cancer：乳腺癌；ieu-a-1129：乳腺癌數據集名稱；Rotator cuff injury：肩袖損傷：ebi-a-GCST90044700：肩袖損傷數據集名稱
圖7
肩袖損傷對乳腺癌風險的因果關系 MR 結果森林圖
黑點表示使用單個 SNP 估計暴露對結局風險的影響，黑線表示估計值的 95%CI；紅點表示使用 MR Egger 和 IVW 估計暴露對結局風險的總體影響，紅線表示總體估計值的 95%CI。橫坐標為各個 SNP 估計暴露對結局的效應值；縱坐標為所有納入的 SNP；Breast cancer：乳腺癌；ieu-a-1129：乳腺癌數據集名稱；Rotator cuff injury：肩袖損傷：ebi-a-GCST90044700：肩袖損傷數據集名稱
3 討論
眾所周知，乳腺癌患者術后放療可有效降低局部復發轉移及乳腺癌相關死亡率，但術后放療極易出現肩關節功能疼痛以及障礙，甚至最終導致肩袖損傷[31]，但乳腺癌與肩袖損傷關聯的因果關系尚不清楚。本研究旨在從遺傳學預測乳腺癌與肩袖損傷之間的因果關系。兩樣本雙向 MR 結果顯示，乳腺癌是肩袖損傷的危險因素，IVW 結果［β=0.08，SE=0.03，OR=1.08，95%CI（1.02，1.12），P=0.014）］表明與一般人群相比，乳腺癌患者患肩袖損傷的風險高 1.08 倍。通過反向 MR 分析，發現肩袖損傷與乳腺癌不存在因果關聯，這一研究結果進一步肯定了由乳腺癌到肩袖損傷的因果關系。
乳腺癌是一種惡性腫瘤，它的發生與許多因素有關。有研究表明，乳腺癌常常伴隨著高水平的雌激素濃度[32]。近年來，大量研究發現，雌激素可能與肌腱病的發生發展緊密相關，高水平的雌激素濃度可能會使肌腱和韌帶損傷的風險顯著增加[33]。一項回顧性隊列研究表明，高雌激素水平可能通過影響成纖維細胞的增殖和Ⅰ型膠原的產生改變韌帶結構，從而增加肩袖損傷的風險[34]。而當肩袖損傷發生后，肌肉脂肪浸潤極大程度影響患者預后，具有不可逆性，常導致肌腱組織功能減弱、彈性降低，從而影響患者預后及手術修復效果[35]。而脂肪浸潤被證實容易發生在女性以及肥胖患者中[36]，其機制可能是肥胖能激活下丘腦-垂體-腎上腺軸導致雌激素水平升高，過多的脂肪組織會增加循環雌激素的水平，而體外實驗又證明雌激素可刺激人前脂肪細胞的增殖[37]，這些都表明肥胖與雌激素之間存在相互影響，最終會對肩袖肌群的功能產生影響。不僅如此，肥胖可能還會與雌激素共同作用，對膠原蛋白的合成產生影響，從而導致全身肌腱的韌度降低[38]。然而有研究表明，補充雌激素可加快肩袖損傷后肌腱的修復與愈合[39]，所以低濃度雌激素水平并不能作為肩袖損傷的保護因素。
而當乳腺癌患者經過治療后，很大一部分乳腺癌幸存者在治療后會出現上肢問題，包括疼痛、緊繃、麻木、淋巴水腫和活動范圍受限，而肩袖損傷是最常見的并發癥之一[40]，可能是由于乳腺癌手術后，胸小肌的長度縮短可能引發肩胛骨位置的異常偏移，這種姿態不良可能誘發肩部疼痛，甚至演變為撞擊綜合征、肩袖撕裂等問題[41]。此外，乳腺癌手術后引發的腋窩淋巴綜合征也可能誘發肩袖損傷等問題[42]。相關研究發現，物理治療例如乳房切除術瘢痕的機械按摩以及肩胛骨穩定訓練結合心理治療能極大緩解肩部的不適癥狀[43]。
本項研究的優勢在于以下方面：首先，相較于隨機對照試驗，MR 分析能夠在最大程度上排除社會環境、生活方式等混雜因素的干擾。本研究進行了反向因果關系的影響，降低了相關干擾，以及通過評估異質性與多效性，可以進一步提升研究結果的可靠性與穩定性。其次，研究所采用的數據全部源自歐洲人群，異質性相對較低。同時，暴露與結局的 GWAS 數據來自 2 個不重疊的獨立樣本，樣本量較大，從而提升了統計效能。但同時研究仍存在不足之處，研究的數據僅來自歐洲樣本，結果可能受到地域和種族的影響，未來可進一步進行跨地域和種族研究。
綜上所述，通過采用雙向雙樣本 MR 方法，本研究結果支持乳腺癌對肩袖損傷易感性和發展的影響，且乳腺癌術后更會加劇肩袖損傷的發病率。然而，肩袖損傷和乳腺癌之間的聯系沒有被證明是因果關系。這提示應增加乳腺癌患者中肩袖損傷的篩查。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
肩袖損傷是成人最常見的肌肉骨骼疾病之一[1]。研究表明，60 歲以上的人群中會有超過 30%的人出現肩袖撕裂[2]，其特征是肩袖肌群嚴重的炎癥、萎縮纖維化和脂肪浸潤，導致肩袖相關肌肉的不可逆性和持續性退化[3]，其發病原因包括遺傳、吸煙、性激素水平等因素[4]。乳腺癌是臨床上最常見的女性惡性腫瘤之一[5]，多達 91%的乳腺癌患者會出現肩部疾病，如無力、活動受限、僵硬和疼痛[6]。不僅如此，乳腺癌手術治療可能會對肩部肌肉的大小和運動產生負面影響[7-8]，甚至整個肩袖肌群也會表現出不同程度的損傷[9]。許多研究也從肩關節肌肉骨骼的解剖變化、術后并發癥、年齡等因素證實了乳腺癌患者肩關節損傷的病理基礎[10-12]。
孟德爾隨機化（Mendelian randomization, MR）是一種復雜的流行病學技術，通過模擬隨機臨床試驗中參與者的隨機分配，使用種系遺傳變異作為工具變量（instrumental variables, IV），也稱為單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism, SNP），來評估危險因素和疾病之間的因果關系[13]。而在傳統的流行病學研究中，由于混雜因素和反向因果關系的影響，得到的因果推論被認為價值有限[14]。MR 采用遺傳變異作為工具變量，從而規避了混雜因素和反向因果關系的影響[15]。所以，當缺乏臨床隨機對照試驗時，MR 研究是建立因果推斷的重要方法。基于此，本研究設計并完成了一項雙向 MR 分析，旨在探討乳腺癌與肩袖損傷之間的因果關系，為全面理解乳腺癌的具體發病機制提供基礎及為乳腺癌患者提供更好的預防和治療策略。
1 資料與方法
1.1 研究設計
本研究利用全基因組關聯研究（genome-wide association study, GWAS）的匯總統計數據，通過雙向 MR 方法對乳腺癌和肩袖損傷進行因果關聯分析。其中，正向研究是以乳腺癌為暴露因素，以肩袖損傷為結局變量；反向研究則是以肩袖損傷為暴露因素，乳腺癌為結局變量。在本研究中，乳腺癌和肩袖損傷之間的雙向 MR 滿足以下 3 個基本假設：① 相關性假設：遺傳變異與暴露密切相關；② 獨立性假設：遺傳變異與暴露和結局的混雜因素無關；③ 排他性假設：遺傳變異僅通過選定的暴露來影響結局[16]。
1.2 數據來源
乳腺癌的 GWAS 數據來自布里斯托大學的 MRC 綜合流行病學部門于 2017 年開展的一項對 106 776 例歐洲女性的研究（61 282 例乳腺癌病例和 47 494 例對照），受試者來自乳腺癌協會聯盟發現及合作的 68 項研究，約 10 680 257 個 SNP 位點[17]。肩袖損傷的 GWAS 數據來從歐洲生物信息學研究所于 2020 年的一項對 412 011 例歐洲人群的研究，其中包括 5 701 例肩袖損傷患者和 406 310 例具有歐洲血統的對照組，約 16 110 542 個 SNP 位點[18]。文章中使用的 GWAS 數據來源于公共數據庫，均得到了各自機構的倫理批準。GWAS 數據庫研究數據信息見表1。
表1
GWAS 數據庫研究數據信息
1.3 工具變量的篩選
1.3.1 正向 MR 分析
為了滿足相關性假設，本研究選擇了在全基因組范圍內與乳腺癌顯著相關（P<5×10?8）的 SNP，且為保證提取出的 IV 相互獨立，在 R 軟件中設置連鎖不平衡系數為 r2<0.001，連鎖不平衡區域寬度為 kb=10 000[19]。為排除潛在混雜因素或與結局相關的 SNP，使用了 PhenoScannerV2 網站用于交叉引用 IV，設置參數為：P<5×10?8，r2>0.8 以滿足獨立性假設與排他性假設[20]。接下來，合并暴露和結局 GWAS 數據，不在同一 DNA 鏈上測量的 SNP 以及具有中等等位基因頻率的回文 SNP 將被排除在外[21]。最后，計算每個剩余 SNP 的 F 統計量，以測量遺傳 IV 的強度，F≥10 時，表明存在弱工具變量偏倚的可能性較小[22]，F 統計量計算公式為：
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其中，MAF 是次要等位基因頻率，β是給定 SNP 對暴露因子的遺傳效應，SE 是標準誤差，N 是暴露的樣本量，R2 為暴露數據庫中由 SNP 解釋的變異占比。
1.3.2 反向 MR 分析
根據之前的研究[23]，本研究用P<5×10?7 去篩選工具變量來獲取與暴露相關的 SNP，其余設置與正向 MR 相同的篩選閾值以獲取在全基因組范圍內與肩袖損傷顯著相關且不存在連鎖不平衡聚集的 SNP，以滿足相關性假設，檢索 PhenoScannerV2 網站（設置參數為：P<5×10?8，r2>0.8），排除與乳腺癌直接相關的 SNP，以滿足獨立性假設。最后，通過排除與乳腺癌在全基因組范圍內顯著相關的 SNP 以滿足排他性假設。此外，合并暴露和結局 GWAS 數據，排除不在同一 DNA 鏈上測量的 SNP及具有中等等位基因頻率的回文 SNP 。
1.4 統計學方法
在 R 編程環境（4.2.3 版）中使用“TwoSampleMR”包（版本 0.5.7）對納入數據進行統計分析。使用“MRPRESSO”軟件包（1.0 版）進行異常值識別。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，反之采用中位數（下四分位數，上四分位數）表示。計數資料采用例數和百分比表示。雙側檢驗水準α=0.05。
1.4.1 雙向 MR 分析
采用逆方差加權（inverse-variance weighted, IVW）法得到 MR 分析的主要結果[24]。為了補充 IVW，因此還采用了其他分析方法，作為對 IVW 分析結果的補充[25]，即 MR-Egger 法、加權中位數法、加權模型、簡單模型。如果以上 MR 方法估計的因果效應一致，則因果證據真實性的可信度將大大提高。但是，如果這些模型的因果效應估計不一致，則 IVW 方法的結果被視為主要結果[26]。上述結果以比值比（odds ratio, OR） 和 95% 置信區間（confidence interval, CI）表示。
1.4.2 敏感性分析
為了進一步檢驗研究結果的穩定性和可靠性，因此對結果進行敏感性分析、異質性檢驗、水平多效性檢驗。這些研究包括 Cochran Q 檢驗、MR-Egger 回歸法和留一法。通過 Cochran Q 檢驗的 IVW 模型的量化結果，可以確定是否存在潛在的異質性（P<0.05 表示存在異質性）[27]。MR-Egger 回歸中的截距是衡量水平多效性的可靠指標（P<0.05 表示存在多效性），用于判斷各個 SNP 之間是否存在水平多效性，如果截距＞0，說明存在水平多效性，即當沒有暴露因素干擾時，結局仍然存在[28]。此外，本研究還使用 MR-PRESSO 全局檢驗來識別離群值，進一步去除水平多效性，主要是通過去除顯著的異常值來降低水平多效性。如果 MR-PRESSO 全局檢驗的 P<0.05，說明存在離群值，應將其剔除并再次進行 MR 分析，即通過排除異常值以獲得更加接近真實值的估計值[29]。留一法則是每次逐個剔除 1 個 SNP 后，將剩余的 SNP 進行 MR 分析，判斷該 SNP 剔除前后是否存在統計學差異；若存在統計學差異，表明該 SNP 會對效應估計總結果產生影響；若不存在統計學差異，則表明上述 MR 結果穩健，故其被用于評估 MR 結果是否受單個 SNP 所影響[30]。
2 結果
2.1 乳腺癌對肩袖損傷風險的因果關系
2.1.1 工具變量的確定
共納入 61 個與乳腺癌相關且獨立的 SNP，在與肩袖損傷配對時丟失 3 個 SNP，未發現與潛在混雜因素相關的 SNP，去除 7 個回文 SNP（rs10978911、rs35910339、rs4076654、rs4286946、rs4979844、rs55674424、rs6904031），最終納入 51 個 SNP（表2）作為工具變量進行本次 MR。F 值的分布情況顯示，數據呈偏態分布，因此選擇使用中位數來描述其集中趨勢，F 值為 47.377（29.759，686.370），F 值均>10 表示納入的 SNP 與乳腺癌顯著相關，不存在偏倚，結果可靠。
表2
納入正向 MR 分析部分 SNP 信息
2.1.2 MR 分析
將保留的 51 個 SNP 與肩袖損傷結果協調對比，IVW［β=0.08，SE=0.03，OR=1.08，95%CI（1.02，1.12），P=0.014］表明乳腺癌可能作為肩袖損傷的危險因素，然而，其余 4 項檢驗均獲得了相反結果，且 P＞0.05（圖1）。乳腺癌對肩袖損傷風險的因果關系 MR 結果的散點圖和森林圖見圖2、3。可見，乳腺癌會增加患肩袖損傷的風險。
圖1
乳腺癌對肩袖損傷風險的因果關系 MR 結果森林圖
MR：孟德爾隨機化；Exposure：暴露；Methods：方法；MR Rgger：MR-Egger 法；Weighted median：加權中位數法；Inverse variance weighted：逆方差加權法；Simple mode：簡單模型法；Weighted mode：加權模型法；no.SNPs：單核苷酸多態性的數量；Breast cancer：乳腺癌；Rotator cuff injury：肩袖損傷
圖2
乳腺癌對肩袖損傷風險的因果關系 MR 結果的散點圖
橫坐標為單個 SNP 對暴露的效應，縱坐標為單個 SNP 對結局的效應，彩色線為暴露對結局的因果效應估計值擬合線；MR test：孟德爾隨機化方法；Inverse variance weighted：逆方差加權法；MR Egger：MR-Egger 法；Weighted median：加權中位數法；Weighted mode：加權模型法；Simple mode：簡單模型法；Breast cancer：乳腺癌；ieu-a-1129：乳腺癌數據集名稱；Rotator cuff injury：肩袖損傷：ebi-a-GCST90044700：肩袖損傷數據集名稱
圖3
乳腺癌對肩袖損傷風險的因果關系 MR 結果森林圖
黑點表示使用單個 SNP 估計暴露對結局風險的影響，黑線表示估計值的 95%CI；紅點表示使用 MR-Egger 和 IVW 估計暴露對結局風險的總體影響，紅線表示總體估計值的 95%CI。橫坐標為各個 SNP 估計暴露對結局的效應值；縱坐標為所有納入的 SNP；Breast cancer：乳腺癌；ieu-a-
2.1.3 敏感性分析
使用不同的方法進行 Cochran Q 檢驗來評估異質性，IVW（Cochran Q=41.372 93，P=0.80）和 MR Egger（Cochran Q=40.97，P=0.79）都表明工具變量之間沒有異質性；MR-Egger 回歸在本研究數據集中未顯示任何水平多效性效應的跡象（MR-Egger 截距=0.005，P=0.528）。乳腺癌與肩袖損傷風險的因果關系的漏斗圖和留一法分析森林圖見圖4、5。可見，沒有單個 SNP 嚴重違反整體效應。為了驗證早期的發現并識別任何異常值，本研究進行了 MR-PRESSO 檢驗，沒有發現異常值，無需考慮基因多效性對結果造成的影響。
圖4
乳腺癌與肩袖損傷風險的因果關系的漏斗圖
可見漏斗圖圖基本對稱。MR Method：孟德爾隨機化方法；
圖5
乳腺癌對肩袖損傷風險的因果關系留一法分析森林圖
黑點表示剔除此 SNP 后乳腺癌對肩袖損傷的因果效應估計，黑實線表示相應的 95%CI；紅點表示使用篩選過的 SNP 估計乳腺癌對肩袖損傷風險的整體因果效應，紅線表示合并估計相應的 95%CI。MR leave-one-out sensitivity analysis：孟德爾隨機化留一法敏感性分析； 橫坐標為剔除各個 SNP 估計乳腺癌對肩袖損傷的效應值；縱坐標為所有逐個剔除的 SNP；Breast cancer：乳腺癌；ieu-a-
2.2 肩袖損傷對乳腺癌風險的因果關系
2.2.1 工具變量的確定
共納入 4 個與肩袖損傷相關且獨立的 SNP，在與乳腺癌配對時丟失 1 個 SNP，未發現與潛在混雜因素相關及回文 SNP，最終納入 3 個 SNP（rs4772085、rs227752 和 rs4725069）作為工具變量進行本次 MR，F 值分別為 25.734、25.748、34.175，F 值均>10，表示納入的 SNP 與肩袖損傷顯著相關，不存在偏倚，結果可靠。
2.2.2 MR 分析
對 3 個 SNP 進行進一步分析，IVW［β=?0.05，SE=0.05，OR=0.95，95%CI（0.86，1.05），P=0.334］、加權中位數［β=?0.07，SE=0.06，OR=0.93，95%CI（0.83，1.05），P=0.252］、MR-Egger 法［β=?0.21，SE=0.33，OR=0.81，95%CI（0.43，1.53），P=0.632］、簡單模型［β=?0.10，SE=0.08，OR=0.90，95%CI（0.76，1.07），P=0.357］、加權模型法［β=?0.10，SE=0.07，OR=0.90，95%CI（0.76，1.07），P=0.350］均顯示高度相似性，表明支持肩袖損傷增加與發生乳腺癌風險之間存在顯著關聯的證據有限，見圖1。
2.2.3 敏感性分析
使用不同的方法進行 Cochran Q 檢驗來評估異質性，IVW 結果（Cochran Q=2.14，P=0.34）和 MR Egger（Cochran Q=1.70，P=0.19）都表明工具變量之間沒有異質性。肩袖損傷對乳腺癌風險的因果關系 MR 結果的散點圖、森林圖見圖6、7。可見，肩袖損傷會增加患乳腺癌風險的證據有限。
圖6
肩袖損傷對乳腺癌風險的因果關系 MR 結果的散點圖
橫坐標為單個 SNP 對暴露的效應，縱坐標為單個 SNP 對結局的效應，彩色線為暴露對結局的因果效應估計值擬合線；MR test：孟德爾隨機化方法；Inverse variance weighted：逆方差加權法；MR Egger：MR-Egger 法；Weighted median：加權中位數法；Weighted mode：加權模型法；Simple mode：簡單模型法；Breast cancer：乳腺癌；ieu-a-1129：乳腺癌數據集名稱；Rotator cuff injury：肩袖損傷：ebi-a-GCST90044700：肩袖損傷數據集名稱
圖7
肩袖損傷對乳腺癌風險的因果關系 MR 結果森林圖
黑點表示使用單個 SNP 估計暴露對結局風險的影響，黑線表示估計值的 95%CI；紅點表示使用 MR Egger 和 IVW 估計暴露對結局風險的總體影響，紅線表示總體估計值的 95%CI。橫坐標為各個 SNP 估計暴露對結局的效應值；縱坐標為所有納入的 SNP；Breast cancer：乳腺癌；ieu-a-1129：乳腺癌數據集名稱；Rotator cuff injury：肩袖損傷：ebi-a-GCST90044700：肩袖損傷數據集名稱
3 討論
眾所周知，乳腺癌患者術后放療可有效降低局部復發轉移及乳腺癌相關死亡率，但術后放療極易出現肩關節功能疼痛以及障礙，甚至最終導致肩袖損傷[31]，但乳腺癌與肩袖損傷關聯的因果關系尚不清楚。本研究旨在從遺傳學預測乳腺癌與肩袖損傷之間的因果關系。兩樣本雙向 MR 結果顯示，乳腺癌是肩袖損傷的危險因素，IVW 結果［β=0.08，SE=0.03，OR=1.08，95%CI（1.02，1.12），P=0.014）］表明與一般人群相比，乳腺癌患者患肩袖損傷的風險高 1.08 倍。通過反向 MR 分析，發現肩袖損傷與乳腺癌不存在因果關聯，這一研究結果進一步肯定了由乳腺癌到肩袖損傷的因果關系。
乳腺癌是一種惡性腫瘤，它的發生與許多因素有關。有研究表明，乳腺癌常常伴隨著高水平的雌激素濃度[32]。近年來，大量研究發現，雌激素可能與肌腱病的發生發展緊密相關，高水平的雌激素濃度可能會使肌腱和韌帶損傷的風險顯著增加[33]。一項回顧性隊列研究表明，高雌激素水平可能通過影響成纖維細胞的增殖和Ⅰ型膠原的產生改變韌帶結構，從而增加肩袖損傷的風險[34]。而當肩袖損傷發生后，肌肉脂肪浸潤極大程度影響患者預后，具有不可逆性，常導致肌腱組織功能減弱、彈性降低，從而影響患者預后及手術修復效果[35]。而脂肪浸潤被證實容易發生在女性以及肥胖患者中[36]，其機制可能是肥胖能激活下丘腦-垂體-腎上腺軸導致雌激素水平升高，過多的脂肪組織會增加循環雌激素的水平，而體外實驗又證明雌激素可刺激人前脂肪細胞的增殖[37]，這些都表明肥胖與雌激素之間存在相互影響，最終會對肩袖肌群的功能產生影響。不僅如此，肥胖可能還會與雌激素共同作用，對膠原蛋白的合成產生影響，從而導致全身肌腱的韌度降低[38]。然而有研究表明，補充雌激素可加快肩袖損傷后肌腱的修復與愈合[39]，所以低濃度雌激素水平并不能作為肩袖損傷的保護因素。
而當乳腺癌患者經過治療后，很大一部分乳腺癌幸存者在治療后會出現上肢問題，包括疼痛、緊繃、麻木、淋巴水腫和活動范圍受限，而肩袖損傷是最常見的并發癥之一[40]，可能是由于乳腺癌手術后，胸小肌的長度縮短可能引發肩胛骨位置的異常偏移，這種姿態不良可能誘發肩部疼痛，甚至演變為撞擊綜合征、肩袖撕裂等問題[41]。此外，乳腺癌手術后引發的腋窩淋巴綜合征也可能誘發肩袖損傷等問題[42]。相關研究發現，物理治療例如乳房切除術瘢痕的機械按摩以及肩胛骨穩定訓練結合心理治療能極大緩解肩部的不適癥狀[43]。
本項研究的優勢在于以下方面：首先，相較于隨機對照試驗，MR 分析能夠在最大程度上排除社會環境、生活方式等混雜因素的干擾。本研究進行了反向因果關系的影響，降低了相關干擾，以及通過評估異質性與多效性，可以進一步提升研究結果的可靠性與穩定性。其次，研究所采用的數據全部源自歐洲人群，異質性相對較低。同時，暴露與結局的 GWAS 數據來自 2 個不重疊的獨立樣本，樣本量較大，從而提升了統計效能。但同時研究仍存在不足之處，研究的數據僅來自歐洲樣本，結果可能受到地域和種族的影響，未來可進一步進行跨地域和種族研究。
綜上所述，通過采用雙向雙樣本 MR 方法，本研究結果支持乳腺癌對肩袖損傷易感性和發展的影響，且乳腺癌術后更會加劇肩袖損傷的發病率。然而，肩袖損傷和乳腺癌之間的聯系沒有被證明是因果關系。這提示應增加乳腺癌患者中肩袖損傷的篩查。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
