引用本文： 段娟, 李可, 何睿, 胡雯. 負載姜黃素-維生素 E 復合物的溫敏水凝膠對放射性口腔黏膜炎小鼠的治療效果分析. 華西醫學, 2025, 40(1): 60-67. doi: 10.7507/1002-0179.202409089 復制
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放射性口腔黏膜炎（radiation-induced oral mucositis, RIOM）是指電離輻射引起的口腔黏膜損傷，臨床上多見于頭頸部惡性腫瘤患者放化療過程中[1]，可致患者口腔疼痛、吞咽困難、營養供給不足等問題[2]。RIOM 的發生致使頭頸癌患者放化療延遲、停止或劑量下調，嚴重影響患者癌癥治療效果、預后及生存質量[3]。盡管目前臨床上已有多種治療 RIOM 的方法，如抗炎藥物、天然藥物、生長因子、抗菌劑和麻醉鎮痛劑等，但療效均有限，且可能伴隨副作用[4-5]，因此，深入研究并開發出有效安全的 RIOM 預防和治療新策略，對改善患者臨床癥狀、提高預后及生存質量以及優化癌癥綜合治療效果具有重要意義。姜黃素是從姜黃、莪術、郁金等天然植物中提取的多酚類化合物[6]，具有良好的抑菌[7]、抗氧化[8]、抗炎效果[9-10]，目前許多研究發現姜黃素及其衍生物對 RIOM 的發病進程有較好的抑制作用，可作為治療 RIOM 的有效手段[11-14]。然而，單獨的姜黃素因水溶性低、穩定性差、生物利用率低等特性，在臨床中實際應用的可能性受到極大限制[15]。Huang 等[16]發現，姜黃素可與維生素 E（vitamin E, VE）發生酯化反應形成具有自組裝性能的姜黃素-VE 衍生物，極大地改善了姜黃素的水溶性和穩定性。此外，VE 作為一種天然抗氧化劑，可保護細胞免受氧化損傷[17]，也可增加膠原蛋白、纖維蛋白等合成，保護細胞膜結構，促進細胞再生與黏膜上皮化，有利于口腔黏膜損傷后的修復[18]。但目前對姜黃素-VE 復合物防治 RIOM 的效果尚未有驗證。因此，本研究以泊洛沙姆溫敏水凝膠為載體[19]，負載姜黃素-VE 復合物，制作成載有姜黃素-VE 復合物的溫敏水凝膠（以下簡稱“姜黃素-VE 凝膠”），實現姜黃素-VE 復合物的口腔黏膜給藥，并從姜黃素-VE 凝膠對小鼠舌組織炎癥水平、氧化應激水平及 DNA 損傷修復幾個方向觀察其對 RIOM 的治療效果，為 RIOM 的臨床治療提供新的可能。
1 材料與方法
1.1 試劑與儀器
1.1.1 藥物與試劑
姜黃素（北京索萊寶科技有限公司）；D-α-生育酚琥珀酸酯、泊洛沙姆 F127、泊洛沙姆 F68（上海源葉生物科技有限公司）；二環己基二亞胺、4-二甲氨基吡啶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；殼聚糖（上海麥克林生化科技股份有限公司）；4% 多聚甲醛固定液（合肥白鯊生物科技公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、過氧化氫酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）、丙二醛檢測試劑盒（南京建成生物公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α, TNF-α）、白細胞介素（interleukin, IL）-1β 及 IL-6 酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；磷酸化組蛋白 H2AX（phosphorylated histone H2AX, γ-H2AX）單克隆抗體（成都正能生物公司）、核轉錄因子紅系 2 相關因子 2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2, Nrf2）單克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白 G、乙二胺四乙酸抗原修復液、檸檬酸鹽緩沖液、蘇木素（武漢塞維爾生物科技有限公司）；伊紅（合肥博美生物公司）；二氨基聯苯胺顯色試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）。
1.1.2 儀器
旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器公司）；恒溫磁力攪拌器（上海滬西分析儀器有限公司）；Nicolet Nexus670 紅外光譜儀（美國 Thermo Nicolet 儀器公司）；NETZSCH 旋轉流變儀 Kinexus Lab+（德國耐馳儀器公司）；Prisma E 掃描電鏡、Scientific Sorvall ST16R 臺式離心機、Multiskan FC1510 酶標儀（美國 Thermo Fisher 儀器公司）；FreeZone 真空冷凍干燥機（美國 Labconco 公司）；X-RAY 小動物精準輻照儀（美國 Radsource 科技公司）；RM2016 轉輪式切片機（德國 Leica 公司）；自動脫水機（武漢俊杰電子科技公司）；組織包埋機、病理組織漂烘儀（常州中威電子儀器廠）；DP27 熒光倒置顯微鏡（日本 Olympus 株式會社）；zwickLine Z2.5 TN﹢ 電子萬能試驗機（德國 ZWICK/Roell 公司）。
1.2 姜黃素-VE 凝膠的合成與性能測定
1.2.1 姜黃素-VE 復合物的合成及表征
姜黃素-VE 復合物的合成參照 Huang 等[16]和 Zhang 等[20]的方法：稱取 D-α-生育酚琥珀酸酯
1.2.2 姜黃素-VE 凝膠的合成及表征
吸取 100 μL Tween80 超聲分散于 5 mL 去離子水中，稱取 20 mg 姜黃素-VE 復合物溶于 1 mL 二甲基亞砜，吸取 250 μL 緩慢滴加于上述去離子水，制備姜黃素-VE 復合物制劑。滴加 28.6 μL 冰醋酸于姜黃素-VE 復合制劑中，定容至 5 mL，使得冰醋酸濃度為 0.1 mol/L。稱取一定質量的殼聚糖溶解于上述制劑，室溫下磁力攪拌 1 h，可得到質量分數為 0.5% 的殼聚糖溶液。分別稱取質量比為 20∶5 的泊洛沙姆 F127 和 F68 溶于殼聚糖溶液，4℃下放置 24 h 充分溶脹，得到澄清黏稠的姜黃素-VE 凝膠。通過流變儀進行流變學分析以評估凝膠的凝膠化溫度。將制備好的姜黃素-VE 凝膠置于液氮中速凍后真空冷凍干燥得到凍干樣品，噴金后掃描電鏡觀察其內部結構及微觀形態。
1.2.3 姜黃素-VE 凝膠性能測定
① 溶脹性：準確稱取 100 mg（W0）冷凍干燥后的空白凝膠、姜黃素-VE 凝膠，置于 20 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）（pH=7.4）中，于 37℃下浸泡，不同時間點下用濾紙吸干凝膠表面水分并稱重（WS），直到凝膠樣品達到溶脹平衡，質量不再變化。溶脹率計算公式：溶脹率=（WS–W0）/W0。
② 降解性：準確稱取 100 mg（W0）冷凍干燥后的空白凝膠、姜黃素-VE 凝膠，置于 20 mL PBS（pH=7.4）中，放入恒溫搖床（37℃，100 r/min）中孵育，每 12 小時取出水凝膠，真空冷凍干燥后稱重，記錄重量（WS）。降解率計算公式：降解率=（W0–WS）/W0。
③ 黏附性：模擬口腔濕潤環境，采用搭接剪切實驗測定空白凝膠及姜黃素-VE 凝膠的黏附性。新鮮豬皮嚴格去除表面毛發及油脂，并切割為 60 mm×15 mm 大小，浸泡于人工唾液 1 h 備用。分別將 100 μL 空白凝膠、姜黃素-VE 凝膠均勻涂抹于兩塊豬皮表面，涂抹區域面積為 15 mm×15 mm，37℃下穩定 1 h 后，通過萬能試驗機測定黏附性能。拉伸速度 5 mm/min，黏附強度由最大拉伸力（單位 N）除以兩塊豬皮搭接區域面積（單位 m2）表示。
1.3 動物實驗
1.3.1 實驗動物及分組
30 只體重在 21～23 g 的 8 周齡無特定病原體級雄性 BALB/C 小鼠，購于四川維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（川）2023-0040。采用隨機數字表將小鼠分為空白組、模型組（輻射組）、輻射+凝膠組，每組各 10 只。小鼠全程飼養于四川大學華西基礎與法醫學院動物實驗中心，環境溫度 20～26℃，相對濕度 40%～70%，適應性喂養 7 d，期間小鼠自由飲水、進食。動物實驗經四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會批準，倫理備案號：20240618001。
1.3.2 RIOM 動物模型建立
RIOM 模型建立采用單次大劑量輻射。小鼠稱重后，腹腔注射 0.3% 戊巴比妥鈉（3.5 mL/kg）麻醉小鼠，仰臥位固定于鉛盒中，露出頭頸部，其余部分采用厚度為 5 mm 的鉛板覆蓋以隔絕電離輻射，置于 X-RAY 小動物精準輻照儀內進行頭頸部局部放療，放射條件：電壓 160 kV，電流 20 mA，總放射劑量 25 Gy，劑量率 1.903 Gy/min；空白組只麻醉不進行輻射。
1.3.3 給藥方法
輻射當天記為第 0 天，于輻射后第 1 天進行治療干預，連續 7 d。空白組、輻射組給予常規飼料及飲水，此外不作任何處理；輻射+凝膠組除常規飼料及飲水外，每日上午 10:00、下午 18:00 各給予凝膠干預 1 次。凝膠干預方式為：定量吸取 100 μL 姜黃素-VE 凝膠，采用無菌棉簽充分涂抹于小鼠口腔，禁食禁水 1 h 后自由飲水、進食。第 8 天腹腔注射麻醉頸椎脫臼處死小鼠，收集指標。
1.3.4 檢測指標
① 小鼠一般狀態及體重：輻射當天及輻射后每日同一時間觀察小鼠一般情況，記錄小鼠體重。
② 小鼠潰瘍面積的測量：小鼠頸椎脫臼處死后立即取小鼠舌組織，用棉簽蘸取 1% 乙酸溶液清洗舌組織表面，均勻涂抹 1% 甲苯胺藍染液后靜置 5 min，1% 乙酸溶液充分清洗多余染液，拍照后 Image-J 分析潰瘍面積、黏膜炎面積與舌組織全面積比例。
③ 組織病理觀察：甲苯胺藍染色后的舌組織 PBS 清洗 2 次后置于 4% 多聚甲醛中固定 24～48 h，沿矢狀面將舌組織一分為二，經脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色后脫水封片，顯微鏡下觀察并拍照。
④ 小鼠舌組織炎癥因子水平的測定：采用 ELISA 測定小鼠舌組織 TNF-α、IL-1β、IL-6 的水平。剪碎的組織與預冷的 PBS 按 1∶9 的重量體積比混合，在組織勻漿機中充分勻漿，4℃，500×g 離心 10 min，得到 10% 勻漿上清液，取上清液按照 ELISA 檢測步驟測定各炎癥因子的水平。
⑤ 小鼠舌組織抗氧化水平的測定：測定小鼠舌組織中 SOD、CAT、GSH-Px 的活性及丙二醛的含量。剪碎的組織按重量體積比 1∶9 的比例加入生理鹽水，在組織勻漿機中充分勻漿，400×g，離心 10 min，取上清液，嚴格遵循說明書中的操作步驟進行測定。
⑥ 小鼠舌組織 γ-H2AX、Nrf2 分布表達：小鼠舌組織固定、取材、脫水、包埋、切片、脫蠟、抗原修復后進行內源性過氧化物酶阻斷，滴加牛血清白蛋白室溫封閉 20 min，對應一抗稀釋后（Nrf2 1∶200；γ-H2AX 1∶200）孵育，4℃過夜。取出過夜孵育組織復溫后 PBS 洗滌，滴加二抗 37℃孵育 30 min，PBS 洗滌后二氨基聯苯胺顯色，使用蘇木素復染細胞核，脫水封片后顯微鏡下觀察，每個切片隨機選取 3 個視野拍照，Image-J 分析陽性細胞數。
1.4 統計學方法
采用 SPSS Statistics 26.0 軟件進行統計學分析。計量資料符合正態分布，采用均數±標準差表示。方差齊的計量資料組間進行 t 檢驗或單因素方差分析，使用 LSD 法進行多重比較；不符合方差齊性的計量資料采用 Welch 檢驗，使用 Games-Howell 法進行多重比較。重復測量的資料采用重復測量方差分析。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 姜黃素-VE 凝膠的合成及性能測定結果
2.1.1 姜黃素-VE 復合物傅里葉紅外光譜分析
如圖1 所示，姜黃素的主要特征峰出現在
圖1
姜黃素-VE 復合物傅里葉紅外光譜結果圖
VE：維生素 E；CUR：姜黃素；VE-SA：D-α-生育酚琥珀酸酯
2.1.2 姜黃素-VE 凝膠的表征
如圖2a 所示，當溫度低于 30℃時，姜黃素-VE 凝膠的 G’（儲存模量）低于 G’’（損失模量），而隨著溫度的升高，在一定的頻率和應變值下，G’與 G’’均隨著溫度升高而升高，但當溫度到達 30℃后，G’開始高于 G’’，此時凝膠發生溶膠-凝膠反應，由液態的溶膠變為固態的凝膠，表明姜黃素-VE 凝膠具有溫敏性，當溫度升高到 30℃時可成凝膠，即在口腔溫度條件下，姜黃素-VE 凝膠可以固態凝膠的狀態黏附在口腔黏膜上。
圖2
姜黃素-VE 凝膠溫度-G’/G’’變化曲線及凍干姜黃素-VE 凝膠掃描電鏡圖
a. 溫度-G’/G’’變化曲線；b. 凍干姜黃素-VE 凝膠掃描電鏡圖。VE：維生素 E；G’：儲存模量；G’’：損失模量
掃描電鏡下姜黃素-VE 凝膠結構如圖2b 所示，觀察可見姜黃素-VE 凝膠凍干后內部微觀結構呈現出多孔網狀結構，孔徑分布主要在 5～20 μm，該結構有利于小分子藥物、水及營養物質等進出，具有藥物緩釋作用，有利于傷口愈合。
2.1.3 凝膠性能
① 溶脹性：如圖3a 所示，空白凝膠在 4 h 內快速吸水，溶脹率超過 300%，而后達到溶脹平衡，表明空白凝膠有較好的溶脹性能，可以適當吸收并儲存水分，而負載姜黃素-VE 復合物對凝膠溶脹性能無顯著影響（P>0.05）。
圖3
凝膠性能測定結果
a. 凝膠溶脹率（
② 降解性：如圖3b 所示，24 h 內空白凝膠、姜黃素-VE 凝膠降解率分別為 80.506%、76.912%，而 48 h 后兩種凝膠降解率均超過 95%，表明姜黃素-VE 復合物的加入對凝膠降解速率無顯著影響（P>0.05）。
③ 黏附性：如圖3c 所示，在模擬口腔濕潤環境下，空白凝膠黏附強度為 13.300 kPa，姜黃素-VE 凝膠為 12.748 kPa，差異無統計學意義（P>0.05），且兩種凝膠的黏附強度均高于常見敷料（0～5 kPa），表明凝膠可穩定黏附在口腔環境內，延長藥物與創口作用時間。
2.2 動物實驗結果
2.2.1 小鼠體重變化
如圖4a 所示，輻射前各組小鼠體重差異無統計學意義（P>0.05）。空白組輻射前與輻射后第 7 天小鼠體重差異無統計學意義（P>0.05）；輻射組、輻射+凝膠組小鼠輻射后第 7 天較輻射前體重顯著下降（P<0.05），但輻射+凝膠組小鼠體重從第 5 天開始高于輻射組，在第 7 天時兩組小鼠體重差異具有統計學意義（P<0.05）。
圖4
小鼠體重變化和舌組織甲苯胺藍染色彩色像
a. 各組小鼠體重變化； b. 小鼠舌組織甲苯胺藍染色彩色像
2.2.2 小鼠潰瘍面積比較
如圖4b、表1 所示，正常小鼠舌組織呈粉紅色，質地柔軟濕潤，僅見 1 處甲苯胺藍點狀陽性著色；輻射組小鼠舌組織出現黏膜炎甚至潰瘍，甲苯胺藍染色后舌體顏色變深，潰瘍區域出現明顯藍色陽性著色，潰瘍主要出現在舌根處；輻射+凝膠組較輻射組潰瘍面積顯著減少，可見散在點狀陽性著色。輻射組潰瘍面積占比（潰瘍面積/舌組織全面積）27.21%，黏膜炎面積占比（黏膜炎面積/舌組織全面積）59.77%，姜黃素-VE 凝膠干預后潰瘍面積、黏膜炎面積占比下降至 1.74%、19.10%，差異有統計學意義（P<0.05）。
表1
各組小鼠舌組織潰瘍面積及黏膜炎面積占比（n=5，x±s，%）
2.2.3 組織病理觀察
如圖5 所示，空白組小鼠舌組織上皮結構完整，細胞排列整齊，上皮及固有層未有炎癥細胞浸潤；輻射組上皮結構完整性消失，大部分上皮脫落，固有層可見大量炎性細胞浸潤；輻射+凝膠組小鼠舌組織上皮層結構分層略有紊亂，上皮細胞數量減少，細胞排列紊亂，基底層消失，上皮厚度較正常組織略有降低，但未見鱗狀上皮脫落，上皮結構基本完整，僅在固有層有少量炎性細胞浸潤。
圖5
各組小鼠舌組織蘇木精-伊紅染色圖（×200）
2.2.4 小鼠舌組織炎癥因子水平比較
如表2 所示，與空白組相比，輻射組 TNF-α、IL-1β 及 IL-6 含量均升高，且差異有統計學意義（P<0.05）；在給予姜黃素-VE 凝膠干預后，小鼠舌組織 TNF-α、IL-1β 及 IL-6 含量較輻射組均出現顯著下降（P<0.05）。
表2
各組小鼠舌組織炎癥因子水平比較（n=5，x±s，pg/mgprot）
2.2.5 各組小鼠舌組織抗氧化水平比較
如表3 所示，與空白組相比，輻射組小鼠舌組織 SOD、CAT 活性下降，丙二醛水平升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；而與輻射組相比，輻射+凝膠組小鼠舌組織 CAT 活性增加，差異有統計學意義（P<0.05）。
表3
各組小鼠舌組織抗氧化水平比較（n=3，x±s）
2.2.6 小鼠舌組織 Nrf2、γ-H2AX 的分布表達
如圖6、表4 所示，與空白組相比，輻射組 Nrf2 表達下調，但差異無統計學意義（P>0.05）；γ-H2AX 表達量增加，差異有統計學意義（P<0.05）。姜黃素-VE 凝膠干預后，Nrf2 表達較輻射組上調，但差異無統計學意義（P>0.05）；γ-H2AX 表達量下降，差異有統計學意義（P<0.05）。
圖6
各組舌組織 Nrf2 和 γ-H2AX 免疫組織化學染色像（×400）
Nrf2：核轉錄因子紅系 2 相關因子 2；γ-H2AX：磷酸化組蛋白 H2AX
表4
各組小鼠 Nrf2、γ-H2AX 表達陽性細胞占比（n=3，x±s，%）
3 討論
RIOM 以口腔潰瘍為主，患者可出現口腔紅腫、糜爛，進一步引起口腔劇烈的疼痛，從而減少患者攝食量，影響患者預后及生活質量[21]。本研究深入探討了姜黃素-VE 凝膠在治療 RIOM 中的效果。在輻射誘導的口腔潰瘍模型中，我們發現輻射組小鼠出現了多處口腔潰瘍，體重也呈現下降趨勢，特別是在急性潰瘍期，體重下降更為顯著。然而，姜黃素-VE 凝膠的應用顯著減少了輻射引起的口腔潰瘍，改善了小鼠的進食量，并緩解了體重減輕的現象。
根據 Sonis[22]于 2004 年提出的 RIOM 五階段理論，放療過程中，電離輻射直接損傷細胞 DNA，導致細胞程序性死亡。γ-H2AX 作為 DNA 雙鏈斷裂的生物標志物，當 DNA 損傷，雙鏈斷裂時，組蛋白 H2A 的 139 位絲氨酸迅速磷酸化，生成 γ-H2AX[23]。Zhang 等[24]通過制備四面體框架核酸藥物遞送系統負載姜黃素用以治療 RIOM 的研究發現，相較于輻射組和單獨的四面體框架核酸材料，負載姜黃素的四面體核酸材料可以顯著減少輻射后細胞核內 γ-H2AX 的表達。本研究中，在輻射后小鼠舌組織中 γ-H2AX 的表達顯著升高，而姜黃素-VE 凝膠的應用顯著降低了 γ-H2AX 的表達，提示姜黃素-VE 凝膠對輻射引起的 DNA 損傷具有保護作用。
在輻射后的生物效應研究中，我們觀察到 SOD、CAT 等抗氧化酶活性的下降和丙二醛含量的升高，這些變化反映了輻射引起的氧化應激。然而，輻射+凝膠治療組的小鼠顯示出 CAT 活性的增加，這表明姜黃素-VE 凝膠能夠抑制輻射引起的氧化應激。此外，多項研究指出，姜黃素可能通過依賴性上調 Nrf2 的表達或促使其核易位，促進 SOD、CAT、GSH-Px 等抗氧化酶的活性，進而清除活性氧[25-27]。而在本研究中，姜黃素-VE 凝膠上調了受輻射抑制的 Nrf2 的表達，但差異無統計學意義，因此姜黃素-VE 抑制輻射后氧化應激的機制仍需進一步探究。
進入炎癥反應階段后，大量包括 TNF-α、IL-1β、IL-6 在內的炎癥因子釋放，招募額外的單核細胞和中性粒細胞，增加血管內皮對炎癥細胞的通透性從而導致組織損傷、上皮細胞變薄、口腔黏膜損傷，若炎癥反應持續進行，將致使潰瘍形成、細菌定植[22]。本研究發現，姜黃素-VE 凝膠可有效降低在輻射后增加的 TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子的水平，有效抑制組織炎癥反應。
綜上所述，姜黃素-VE 凝膠可通過減少輻射引起的 DNA 損傷，改善輻射后氧化應激以及有效降低炎癥因子水平來延緩或減弱 RIOM 的進程，對 RIOM 的治療具有潛在療效。這些發現為 RIOM 的臨床治療提供了新的策略，并為進一步的研究和藥物開發奠定了基礎。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
放射性口腔黏膜炎（radiation-induced oral mucositis, RIOM）是指電離輻射引起的口腔黏膜損傷，臨床上多見于頭頸部惡性腫瘤患者放化療過程中[1]，可致患者口腔疼痛、吞咽困難、營養供給不足等問題[2]。RIOM 的發生致使頭頸癌患者放化療延遲、停止或劑量下調，嚴重影響患者癌癥治療效果、預后及生存質量[3]。盡管目前臨床上已有多種治療 RIOM 的方法，如抗炎藥物、天然藥物、生長因子、抗菌劑和麻醉鎮痛劑等，但療效均有限，且可能伴隨副作用[4-5]，因此，深入研究并開發出有效安全的 RIOM 預防和治療新策略，對改善患者臨床癥狀、提高預后及生存質量以及優化癌癥綜合治療效果具有重要意義。姜黃素是從姜黃、莪術、郁金等天然植物中提取的多酚類化合物[6]，具有良好的抑菌[7]、抗氧化[8]、抗炎效果[9-10]，目前許多研究發現姜黃素及其衍生物對 RIOM 的發病進程有較好的抑制作用，可作為治療 RIOM 的有效手段[11-14]。然而，單獨的姜黃素因水溶性低、穩定性差、生物利用率低等特性，在臨床中實際應用的可能性受到極大限制[15]。Huang 等[16]發現，姜黃素可與維生素 E（vitamin E, VE）發生酯化反應形成具有自組裝性能的姜黃素-VE 衍生物，極大地改善了姜黃素的水溶性和穩定性。此外，VE 作為一種天然抗氧化劑，可保護細胞免受氧化損傷[17]，也可增加膠原蛋白、纖維蛋白等合成，保護細胞膜結構，促進細胞再生與黏膜上皮化，有利于口腔黏膜損傷后的修復[18]。但目前對姜黃素-VE 復合物防治 RIOM 的效果尚未有驗證。因此，本研究以泊洛沙姆溫敏水凝膠為載體[19]，負載姜黃素-VE 復合物，制作成載有姜黃素-VE 復合物的溫敏水凝膠（以下簡稱“姜黃素-VE 凝膠”），實現姜黃素-VE 復合物的口腔黏膜給藥，并從姜黃素-VE 凝膠對小鼠舌組織炎癥水平、氧化應激水平及 DNA 損傷修復幾個方向觀察其對 RIOM 的治療效果，為 RIOM 的臨床治療提供新的可能。
1 材料與方法
1.1 試劑與儀器
1.1.1 藥物與試劑
姜黃素（北京索萊寶科技有限公司）；D-α-生育酚琥珀酸酯、泊洛沙姆 F127、泊洛沙姆 F68（上海源葉生物科技有限公司）；二環己基二亞胺、4-二甲氨基吡啶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；殼聚糖（上海麥克林生化科技股份有限公司）；4% 多聚甲醛固定液（合肥白鯊生物科技公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、過氧化氫酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）、丙二醛檢測試劑盒（南京建成生物公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α, TNF-α）、白細胞介素（interleukin, IL）-1β 及 IL-6 酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；磷酸化組蛋白 H2AX（phosphorylated histone H2AX, γ-H2AX）單克隆抗體（成都正能生物公司）、核轉錄因子紅系 2 相關因子 2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2, Nrf2）單克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白 G、乙二胺四乙酸抗原修復液、檸檬酸鹽緩沖液、蘇木素（武漢塞維爾生物科技有限公司）；伊紅（合肥博美生物公司）；二氨基聯苯胺顯色試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）。
1.1.2 儀器
旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器公司）；恒溫磁力攪拌器（上海滬西分析儀器有限公司）；Nicolet Nexus670 紅外光譜儀（美國 Thermo Nicolet 儀器公司）；NETZSCH 旋轉流變儀 Kinexus Lab+（德國耐馳儀器公司）；Prisma E 掃描電鏡、Scientific Sorvall ST16R 臺式離心機、Multiskan FC1510 酶標儀（美國 Thermo Fisher 儀器公司）；FreeZone 真空冷凍干燥機（美國 Labconco 公司）；X-RAY 小動物精準輻照儀（美國 Radsource 科技公司）；RM2016 轉輪式切片機（德國 Leica 公司）；自動脫水機（武漢俊杰電子科技公司）；組織包埋機、病理組織漂烘儀（常州中威電子儀器廠）；DP27 熒光倒置顯微鏡（日本 Olympus 株式會社）；zwickLine Z2.5 TN﹢ 電子萬能試驗機（德國 ZWICK/Roell 公司）。
1.2 姜黃素-VE 凝膠的合成與性能測定
1.2.1 姜黃素-VE 復合物的合成及表征
姜黃素-VE 復合物的合成參照 Huang 等[16]和 Zhang 等[20]的方法：稱取 D-α-生育酚琥珀酸酯
1.2.2 姜黃素-VE 凝膠的合成及表征
吸取 100 μL Tween80 超聲分散于 5 mL 去離子水中，稱取 20 mg 姜黃素-VE 復合物溶于 1 mL 二甲基亞砜，吸取 250 μL 緩慢滴加于上述去離子水，制備姜黃素-VE 復合物制劑。滴加 28.6 μL 冰醋酸于姜黃素-VE 復合制劑中，定容至 5 mL，使得冰醋酸濃度為 0.1 mol/L。稱取一定質量的殼聚糖溶解于上述制劑，室溫下磁力攪拌 1 h，可得到質量分數為 0.5% 的殼聚糖溶液。分別稱取質量比為 20∶5 的泊洛沙姆 F127 和 F68 溶于殼聚糖溶液，4℃下放置 24 h 充分溶脹，得到澄清黏稠的姜黃素-VE 凝膠。通過流變儀進行流變學分析以評估凝膠的凝膠化溫度。將制備好的姜黃素-VE 凝膠置于液氮中速凍后真空冷凍干燥得到凍干樣品，噴金后掃描電鏡觀察其內部結構及微觀形態。
1.2.3 姜黃素-VE 凝膠性能測定
① 溶脹性：準確稱取 100 mg（W0）冷凍干燥后的空白凝膠、姜黃素-VE 凝膠，置于 20 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）（pH=7.4）中，于 37℃下浸泡，不同時間點下用濾紙吸干凝膠表面水分并稱重（WS），直到凝膠樣品達到溶脹平衡，質量不再變化。溶脹率計算公式：溶脹率=（WS–W0）/W0。
② 降解性：準確稱取 100 mg（W0）冷凍干燥后的空白凝膠、姜黃素-VE 凝膠，置于 20 mL PBS（pH=7.4）中，放入恒溫搖床（37℃，100 r/min）中孵育，每 12 小時取出水凝膠，真空冷凍干燥后稱重，記錄重量（WS）。降解率計算公式：降解率=（W0–WS）/W0。
③ 黏附性：模擬口腔濕潤環境，采用搭接剪切實驗測定空白凝膠及姜黃素-VE 凝膠的黏附性。新鮮豬皮嚴格去除表面毛發及油脂，并切割為 60 mm×15 mm 大小，浸泡于人工唾液 1 h 備用。分別將 100 μL 空白凝膠、姜黃素-VE 凝膠均勻涂抹于兩塊豬皮表面，涂抹區域面積為 15 mm×15 mm，37℃下穩定 1 h 后，通過萬能試驗機測定黏附性能。拉伸速度 5 mm/min，黏附強度由最大拉伸力（單位 N）除以兩塊豬皮搭接區域面積（單位 m2）表示。
1.3 動物實驗
1.3.1 實驗動物及分組
30 只體重在 21～23 g 的 8 周齡無特定病原體級雄性 BALB/C 小鼠，購于四川維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（川）2023-0040。采用隨機數字表將小鼠分為空白組、模型組（輻射組）、輻射+凝膠組，每組各 10 只。小鼠全程飼養于四川大學華西基礎與法醫學院動物實驗中心，環境溫度 20～26℃，相對濕度 40%～70%，適應性喂養 7 d，期間小鼠自由飲水、進食。動物實驗經四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會批準，倫理備案號：20240618001。
1.3.2 RIOM 動物模型建立
RIOM 模型建立采用單次大劑量輻射。小鼠稱重后，腹腔注射 0.3% 戊巴比妥鈉（3.5 mL/kg）麻醉小鼠，仰臥位固定于鉛盒中，露出頭頸部，其余部分采用厚度為 5 mm 的鉛板覆蓋以隔絕電離輻射，置于 X-RAY 小動物精準輻照儀內進行頭頸部局部放療，放射條件：電壓 160 kV，電流 20 mA，總放射劑量 25 Gy，劑量率 1.903 Gy/min；空白組只麻醉不進行輻射。
1.3.3 給藥方法
輻射當天記為第 0 天，于輻射后第 1 天進行治療干預，連續 7 d。空白組、輻射組給予常規飼料及飲水，此外不作任何處理；輻射+凝膠組除常規飼料及飲水外，每日上午 10:00、下午 18:00 各給予凝膠干預 1 次。凝膠干預方式為：定量吸取 100 μL 姜黃素-VE 凝膠，采用無菌棉簽充分涂抹于小鼠口腔，禁食禁水 1 h 后自由飲水、進食。第 8 天腹腔注射麻醉頸椎脫臼處死小鼠，收集指標。
1.3.4 檢測指標
① 小鼠一般狀態及體重：輻射當天及輻射后每日同一時間觀察小鼠一般情況，記錄小鼠體重。
② 小鼠潰瘍面積的測量：小鼠頸椎脫臼處死后立即取小鼠舌組織，用棉簽蘸取 1% 乙酸溶液清洗舌組織表面，均勻涂抹 1% 甲苯胺藍染液后靜置 5 min，1% 乙酸溶液充分清洗多余染液，拍照后 Image-J 分析潰瘍面積、黏膜炎面積與舌組織全面積比例。
③ 組織病理觀察：甲苯胺藍染色后的舌組織 PBS 清洗 2 次后置于 4% 多聚甲醛中固定 24～48 h，沿矢狀面將舌組織一分為二，經脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色后脫水封片，顯微鏡下觀察并拍照。
④ 小鼠舌組織炎癥因子水平的測定：采用 ELISA 測定小鼠舌組織 TNF-α、IL-1β、IL-6 的水平。剪碎的組織與預冷的 PBS 按 1∶9 的重量體積比混合，在組織勻漿機中充分勻漿，4℃，500×g 離心 10 min，得到 10% 勻漿上清液，取上清液按照 ELISA 檢測步驟測定各炎癥因子的水平。
⑤ 小鼠舌組織抗氧化水平的測定：測定小鼠舌組織中 SOD、CAT、GSH-Px 的活性及丙二醛的含量。剪碎的組織按重量體積比 1∶9 的比例加入生理鹽水，在組織勻漿機中充分勻漿，400×g，離心 10 min，取上清液，嚴格遵循說明書中的操作步驟進行測定。
⑥ 小鼠舌組織 γ-H2AX、Nrf2 分布表達：小鼠舌組織固定、取材、脫水、包埋、切片、脫蠟、抗原修復后進行內源性過氧化物酶阻斷，滴加牛血清白蛋白室溫封閉 20 min，對應一抗稀釋后（Nrf2 1∶200；γ-H2AX 1∶200）孵育，4℃過夜。取出過夜孵育組織復溫后 PBS 洗滌，滴加二抗 37℃孵育 30 min，PBS 洗滌后二氨基聯苯胺顯色，使用蘇木素復染細胞核，脫水封片后顯微鏡下觀察，每個切片隨機選取 3 個視野拍照，Image-J 分析陽性細胞數。
1.4 統計學方法
采用 SPSS Statistics 26.0 軟件進行統計學分析。計量資料符合正態分布，采用均數±標準差表示。方差齊的計量資料組間進行 t 檢驗或單因素方差分析，使用 LSD 法進行多重比較；不符合方差齊性的計量資料采用 Welch 檢驗，使用 Games-Howell 法進行多重比較。重復測量的資料采用重復測量方差分析。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 姜黃素-VE 凝膠的合成及性能測定結果
2.1.1 姜黃素-VE 復合物傅里葉紅外光譜分析
如圖1 所示，姜黃素的主要特征峰出現在
圖1
姜黃素-VE 復合物傅里葉紅外光譜結果圖
VE：維生素 E；CUR：姜黃素；VE-SA：D-α-生育酚琥珀酸酯
2.1.2 姜黃素-VE 凝膠的表征
如圖2a 所示，當溫度低于 30℃時，姜黃素-VE 凝膠的 G’（儲存模量）低于 G’’（損失模量），而隨著溫度的升高，在一定的頻率和應變值下，G’與 G’’均隨著溫度升高而升高，但當溫度到達 30℃后，G’開始高于 G’’，此時凝膠發生溶膠-凝膠反應，由液態的溶膠變為固態的凝膠，表明姜黃素-VE 凝膠具有溫敏性，當溫度升高到 30℃時可成凝膠，即在口腔溫度條件下，姜黃素-VE 凝膠可以固態凝膠的狀態黏附在口腔黏膜上。
圖2
姜黃素-VE 凝膠溫度-G’/G’’變化曲線及凍干姜黃素-VE 凝膠掃描電鏡圖
a. 溫度-G’/G’’變化曲線；b. 凍干姜黃素-VE 凝膠掃描電鏡圖。VE：維生素 E；G’：儲存模量；G’’：損失模量
掃描電鏡下姜黃素-VE 凝膠結構如圖2b 所示，觀察可見姜黃素-VE 凝膠凍干后內部微觀結構呈現出多孔網狀結構，孔徑分布主要在 5～20 μm，該結構有利于小分子藥物、水及營養物質等進出，具有藥物緩釋作用，有利于傷口愈合。
2.1.3 凝膠性能
① 溶脹性：如圖3a 所示，空白凝膠在 4 h 內快速吸水，溶脹率超過 300%，而后達到溶脹平衡，表明空白凝膠有較好的溶脹性能，可以適當吸收并儲存水分，而負載姜黃素-VE 復合物對凝膠溶脹性能無顯著影響（P>0.05）。
圖3
凝膠性能測定結果
a. 凝膠溶脹率（
② 降解性：如圖3b 所示，24 h 內空白凝膠、姜黃素-VE 凝膠降解率分別為 80.506%、76.912%，而 48 h 后兩種凝膠降解率均超過 95%，表明姜黃素-VE 復合物的加入對凝膠降解速率無顯著影響（P>0.05）。
③ 黏附性：如圖3c 所示，在模擬口腔濕潤環境下，空白凝膠黏附強度為 13.300 kPa，姜黃素-VE 凝膠為 12.748 kPa，差異無統計學意義（P>0.05），且兩種凝膠的黏附強度均高于常見敷料（0～5 kPa），表明凝膠可穩定黏附在口腔環境內，延長藥物與創口作用時間。
2.2 動物實驗結果
2.2.1 小鼠體重變化
如圖4a 所示，輻射前各組小鼠體重差異無統計學意義（P>0.05）。空白組輻射前與輻射后第 7 天小鼠體重差異無統計學意義（P>0.05）；輻射組、輻射+凝膠組小鼠輻射后第 7 天較輻射前體重顯著下降（P<0.05），但輻射+凝膠組小鼠體重從第 5 天開始高于輻射組，在第 7 天時兩組小鼠體重差異具有統計學意義（P<0.05）。
圖4
小鼠體重變化和舌組織甲苯胺藍染色彩色像
a. 各組小鼠體重變化； b. 小鼠舌組織甲苯胺藍染色彩色像
2.2.2 小鼠潰瘍面積比較
如圖4b、表1 所示，正常小鼠舌組織呈粉紅色，質地柔軟濕潤，僅見 1 處甲苯胺藍點狀陽性著色；輻射組小鼠舌組織出現黏膜炎甚至潰瘍，甲苯胺藍染色后舌體顏色變深，潰瘍區域出現明顯藍色陽性著色，潰瘍主要出現在舌根處；輻射+凝膠組較輻射組潰瘍面積顯著減少，可見散在點狀陽性著色。輻射組潰瘍面積占比（潰瘍面積/舌組織全面積）27.21%，黏膜炎面積占比（黏膜炎面積/舌組織全面積）59.77%，姜黃素-VE 凝膠干預后潰瘍面積、黏膜炎面積占比下降至 1.74%、19.10%，差異有統計學意義（P<0.05）。
表1
各組小鼠舌組織潰瘍面積及黏膜炎面積占比（n=5，x±s，%）
2.2.3 組織病理觀察
如圖5 所示，空白組小鼠舌組織上皮結構完整，細胞排列整齊，上皮及固有層未有炎癥細胞浸潤；輻射組上皮結構完整性消失，大部分上皮脫落，固有層可見大量炎性細胞浸潤；輻射+凝膠組小鼠舌組織上皮層結構分層略有紊亂，上皮細胞數量減少，細胞排列紊亂，基底層消失，上皮厚度較正常組織略有降低，但未見鱗狀上皮脫落，上皮結構基本完整，僅在固有層有少量炎性細胞浸潤。
圖5
各組小鼠舌組織蘇木精-伊紅染色圖（×200）
2.2.4 小鼠舌組織炎癥因子水平比較
如表2 所示，與空白組相比，輻射組 TNF-α、IL-1β 及 IL-6 含量均升高，且差異有統計學意義（P<0.05）；在給予姜黃素-VE 凝膠干預后，小鼠舌組織 TNF-α、IL-1β 及 IL-6 含量較輻射組均出現顯著下降（P<0.05）。
表2
各組小鼠舌組織炎癥因子水平比較（n=5，x±s，pg/mgprot）
2.2.5 各組小鼠舌組織抗氧化水平比較
如表3 所示，與空白組相比，輻射組小鼠舌組織 SOD、CAT 活性下降，丙二醛水平升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；而與輻射組相比，輻射+凝膠組小鼠舌組織 CAT 活性增加，差異有統計學意義（P<0.05）。
表3
各組小鼠舌組織抗氧化水平比較（n=3，x±s）
2.2.6 小鼠舌組織 Nrf2、γ-H2AX 的分布表達
如圖6、表4 所示，與空白組相比，輻射組 Nrf2 表達下調，但差異無統計學意義（P>0.05）；γ-H2AX 表達量增加，差異有統計學意義（P<0.05）。姜黃素-VE 凝膠干預后，Nrf2 表達較輻射組上調，但差異無統計學意義（P>0.05）；γ-H2AX 表達量下降，差異有統計學意義（P<0.05）。
圖6
各組舌組織 Nrf2 和 γ-H2AX 免疫組織化學染色像（×400）
Nrf2：核轉錄因子紅系 2 相關因子 2；γ-H2AX：磷酸化組蛋白 H2AX
表4
各組小鼠 Nrf2、γ-H2AX 表達陽性細胞占比（n=3，x±s，%）
3 討論
RIOM 以口腔潰瘍為主，患者可出現口腔紅腫、糜爛，進一步引起口腔劇烈的疼痛，從而減少患者攝食量，影響患者預后及生活質量[21]。本研究深入探討了姜黃素-VE 凝膠在治療 RIOM 中的效果。在輻射誘導的口腔潰瘍模型中，我們發現輻射組小鼠出現了多處口腔潰瘍，體重也呈現下降趨勢，特別是在急性潰瘍期，體重下降更為顯著。然而，姜黃素-VE 凝膠的應用顯著減少了輻射引起的口腔潰瘍，改善了小鼠的進食量，并緩解了體重減輕的現象。
根據 Sonis[22]于 2004 年提出的 RIOM 五階段理論，放療過程中，電離輻射直接損傷細胞 DNA，導致細胞程序性死亡。γ-H2AX 作為 DNA 雙鏈斷裂的生物標志物，當 DNA 損傷，雙鏈斷裂時，組蛋白 H2A 的 139 位絲氨酸迅速磷酸化，生成 γ-H2AX[23]。Zhang 等[24]通過制備四面體框架核酸藥物遞送系統負載姜黃素用以治療 RIOM 的研究發現，相較于輻射組和單獨的四面體框架核酸材料，負載姜黃素的四面體核酸材料可以顯著減少輻射后細胞核內 γ-H2AX 的表達。本研究中，在輻射后小鼠舌組織中 γ-H2AX 的表達顯著升高，而姜黃素-VE 凝膠的應用顯著降低了 γ-H2AX 的表達，提示姜黃素-VE 凝膠對輻射引起的 DNA 損傷具有保護作用。
在輻射后的生物效應研究中，我們觀察到 SOD、CAT 等抗氧化酶活性的下降和丙二醛含量的升高，這些變化反映了輻射引起的氧化應激。然而，輻射+凝膠治療組的小鼠顯示出 CAT 活性的增加，這表明姜黃素-VE 凝膠能夠抑制輻射引起的氧化應激。此外，多項研究指出，姜黃素可能通過依賴性上調 Nrf2 的表達或促使其核易位，促進 SOD、CAT、GSH-Px 等抗氧化酶的活性，進而清除活性氧[25-27]。而在本研究中，姜黃素-VE 凝膠上調了受輻射抑制的 Nrf2 的表達，但差異無統計學意義，因此姜黃素-VE 抑制輻射后氧化應激的機制仍需進一步探究。
進入炎癥反應階段后，大量包括 TNF-α、IL-1β、IL-6 在內的炎癥因子釋放，招募額外的單核細胞和中性粒細胞，增加血管內皮對炎癥細胞的通透性從而導致組織損傷、上皮細胞變薄、口腔黏膜損傷，若炎癥反應持續進行，將致使潰瘍形成、細菌定植[22]。本研究發現，姜黃素-VE 凝膠可有效降低在輻射后增加的 TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子的水平，有效抑制組織炎癥反應。
綜上所述，姜黃素-VE 凝膠可通過減少輻射引起的 DNA 損傷，改善輻射后氧化應激以及有效降低炎癥因子水平來延緩或減弱 RIOM 的進程，對 RIOM 的治療具有潛在療效。這些發現為 RIOM 的臨床治療提供了新的策略，并為進一步的研究和藥物開發奠定了基礎。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
