引用本文： 陳明學, 吳江, 殷瀚, 眭翔, 劉舒云, 郭全義. 基于低溫沉積3D打印技術構建新型組織工程半月板支架的研究. 中國修復重建外科雜志, 2024, 38(6): 748-754. doi: 10.7507/1002-1892.202402063 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國修復重建外科雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
半月板損傷的再生修復目前依然充滿挑戰[1-2]。近年來，隨著再生醫學和組織工程技術的發展，構建組織工程半月板支架實現半月板損傷的再生修復逐漸得到認可[3-4]。理想的半月板組織工程支架應模擬天然半月板空間結構和微環境，有良好細胞相容性，有利于細胞生長和分化，促進損傷半月板的再生和修復[5-6]。脫細胞基質由于具有仿生成分和天然微結構，在組織工程和再生醫學中得到了廣泛應用[7-8]。其最大優點在于良好生物相容性，可很好地模擬細胞生長微環境，有效促進細胞生長和分化。本團隊前期研究發現脫細胞半月板基質可有效促進細胞黏附、增殖和分化，進而促進損傷半月板再生修復，可以作為理想的生物材料[5，9]。
3D打印技術可以實現高度個性化制造，準確制造出具備復雜結構的支架。然而，傳統熔融沉積3D打印技術因打印過程中需要加熱融化材料，故無法用于脫細胞半月板基質打印。近年，低溫沉積3D打印技術的出現為打印該材料提供了可能。該打印技術是在超低溫（?30～?20℃）平臺上逐層搭建支架，經冷凍干燥和相分離技術實現支架高度連通的大孔-微孔結構[10-11]。相對于傳統熔融沉積3D打印技術，其具有以下優勢：① 超低溫下完成打印，可以有效保護材料生物活性；② 能構建具有高度連通的大孔-微孔結構，提高了支架孔隙率，這種分級多孔結構為細胞營養物質交換和擴散提供了通道[12]。
本研究以脫細胞半月板基質為原料，通過低溫沉積3D打印技術構建新型組織工程半月板支架，評價該支架理化特性和生物相容性，為其用于體內修復損傷半月板組織奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
豬新鮮半月板50個，購于北京岳各莊屠宰場。新生48 h 雄性SD大鼠乳鼠10只，體質量12～18 g；8周齡SD大鼠6只，雌雄不限，體質量約250 g；均購自中國人民解放軍總醫院實驗動物中心。
DNA酶、RNA酶、PBS粉、胰蛋白酶（Sigma-Aldrich公司，美國）； DMEM/F12培養基、FBS、青霉素-鏈霉素雙抗（GIBCO公司，美國）；α-MEM培養基（Corning公司，美國）；甲苯胺藍染色試劑盒、HE染色液（北京瀚海拓新生物技術有限公司）；番紅O染色試劑、天狼猩紅染色試劑（北京索萊寶科技有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；DAPI染液（Molecular Probes公司，美國）；多聚甲醛（北京化學試劑有限公司）；死/活細胞染色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）；鬼筆環肽細胞染色試劑盒（Cytoskeleton公司，美國）。
SUNP BIOMAKER 生物打印機 ［上普博源（北京）生物科技有限公司］；掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；EPOCH TAKE 3 酶標儀（BioTek公司，美國）；激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）；熒光顯微鏡、倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；組織粉碎機（山東九陽股份有限公司）；microCT（GE公司，美國）；Mimics軟件（Materialise公司，比利時）。
1.2 脫細胞半月板基質勻漿制備及觀測
1.2.1 半月板脫細胞方法
參考文獻 ［9，12］ 的改良物理化學聯合方法制備脫細胞半月板基質。具體步驟：將新鮮豬半月板組織切碎，置于10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0）浸泡2 h；置于?80℃冰箱冷凍8 h后取出、室溫下解凍，反復凍融10次；置于37℃ 0.25%胰蛋白酶中，劇烈攪拌24 h，期間每4小時更換1次胰蛋白酶；PBS緩沖液洗滌24 h；DNA酶和RNA酶處理4 h；1%Triton X-100溶液處理24 h；10 mmol/L Tris-HCl緩沖液清洗24 h后，流水持續沖洗3 d以洗去殘余化學試劑。將經上述處理的半月板組織和3倍體積分數的無菌三蒸水放入組織粉碎機內，于4℃反復粉碎30 min；將組織勻漿液進行梯度離心（800×g 離心30 min，取上清；2 500×g離心30 min，取上清；5 000×g離心30 min，取上清；重復以上步驟6次）。最后將收集的上清液以8 000×g離心30 min，收集沉淀即為脫細胞半月板基質勻漿，于4℃條件保存備用。
1.2.2 半月板脫細胞效果觀測
取半月板組織和脫細胞半月板基質勻漿各3個樣本，OCT包埋，冰凍切片，片厚 6 μm；每個樣本取5張切片，4%多聚甲醛固定15 min，蒸餾水洗凈殘留OCT及多聚甲醛后，常規行DAPI及HE染色，分別于熒光顯微鏡和倒置顯微鏡下觀察脫細胞后細胞核殘留情況。另取上述部分冰凍切片復水處理后，參照試劑盒說明行番紅O、甲苯胺藍及天狼猩紅染色，常規脫水封片后于倒置顯微鏡下觀察黏多糖及膠原保留情況。
1.3 新型組織工程半月板支架制備及觀測
1.3.1 脫細胞半月板基質生物墨水制備
將制備的脫細胞半月板基質勻漿置于冷凍干燥機中進行冷凍干燥處理24 h，用組織粉碎機將其打成粉末。取一定質量粉末溶解于5%乙酸中，制備5%（W/V）脫細胞半月板基質生物墨水，調節pH值為7，于4℃條件保存備用。
1.3.2 新型組織工程半月板支架制備
參考本團隊既往構建半月板三維模型方法 ［9］，將前期研究中microCT掃描獲得的兔膝關節半月板影像學數據，以Dicom格式導入Mimics軟件進行半月板三維建模并生成STL文件；將其輸入生物打印機，在G-code文件中規劃打印路徑；參考既往文獻 ［9］ 設置打印參數：生物打印機膠噴頭內徑400 μm、打印速度5 mm/s、絲間距400 μm。打印期間保持打印機注射器溫度約4℃，接收板溫度為–24℃。支架打印后行冷凍干燥24 h，取出后于室溫保存。
1.3.3 大體與掃描電鏡觀察
取制備的新型組織工程半月板支架，大體觀察形態后，經冷凍干燥以及真空噴金處理，掃描電鏡下觀察微觀結構。
1.3.4 支架細胞相容性評價
① 脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）分離培養與傳代：參照文獻 ［13］ 方法進行ADSCs分離、培養和傳代。將10只SD大鼠乳鼠浸泡于75%乙醇溶液處死并消毒，無菌條件下取出雙側腹股溝脂肪墊，置于含青霉素-鏈霉素雙抗的PBS 溶液（pH7.4）中，剪成 1.0～2.0 mm3 碎塊，加入5 mL 0.25%Ⅰ型膠原酶，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中磁力攪拌消化至脂肪顆粒不可見；加入含10%FBS的 DMEM/F12 培養基終止消化，經 100 μm 無菌濾器過濾，以250×g離心 5 min后棄上清液；加入含10% FBS的 DMEM/F12 培養基重懸細胞，移入25 cm2培養瓶，每2天更換1次培養液。待細胞生長至 80%～90% 融合時進行傳代，取第3代細胞進行后續實驗。
② CCK-8 檢測：將新型組織工程半月板支架（0.2 cm×0.2 cm）置于6孔板中，并在支架上接種5 000個ADSCs（實驗組），以平面培養的ADSCs為對照組。于37℃、5%CO2培養箱內培養，待細胞貼壁6 h后加入 DMEM/F12培養基，分別于培養1、3、5 d兩組各取5孔，每孔加入2 mL CCK-8工作液，37℃孵育2 h。每孔吸取100 μL液體轉移至新的96孔板，采用酶標儀檢測450 nm處吸光度（A）值。
③ 死/活細胞染色：取ADSCs接種于新型組織工程半月板支架（2×105個/支架），置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，待細胞貼壁6 h后添加含10%FBS的α-MEM培養基進行培養，每2天更換1次培養基。分別于培養1、7 d使用死/活細胞染色試劑盒對支架上細胞進行染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察，活細胞呈綠色熒光、死細胞呈紅色熒光，按照以下公式計算細胞活性：活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×100%。
④ 鬼筆環肽染色：取ADSCs接種于新型組織工程半月板支架（2×105個/支架）；置于37℃、5%CO2培養箱中孵育7 d。取出后依次以4%多聚甲醛固定30 min、0.3%Triton X-100裂解20 min、免疫封閉液封閉30 min。最后用鬼筆環肽和DAPI對支架上細胞的細胞骨架和細胞核染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架鋪展狀態。
1.3.5 體內植入觀察
取6只8周齡SD大鼠，腹腔內注射20 g/L戊巴比妥鈉（30～40 mg/kg）麻醉后，于背部作長約 5 mm切口，切開皮膚、游離皮下組織，然后將大小為1 cm×1 cm的無菌新型組織工程半月板支架植入皮下，每只植入1個支架，縫合切口。術后1、3周各取3只大鼠過量麻醉處死，按照原切口入路取材。將樣本置于40 g/L 多聚甲醛固定30 min，石蠟包埋切片，片厚6 μm，常規HE染色，倒置顯微鏡下觀察炎癥細胞浸潤與支架降解情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS和GraphPad Prism 9.0統計軟件進行分析。計量資料采用Shapiro-Wilk檢驗行正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 半月板脫細胞效果觀察
大體觀察半月板組織呈半月形或C形，脫細胞前呈乳白色纖維軟骨樣組織，質地柔軟、有彈性；脫細胞半月板基質呈透明凝膠狀。DAPI及HE染色示，脫細胞前半月板有大量細胞核結構，脫細胞處理后半月板基質未見細胞核結構，表明具有免疫原性的核酸組織徹底去除。番紅O、甲苯胺藍及天狼猩紅染色示，脫細胞前后均呈陽性，提示脫細胞過程中黏多糖和膠原成分保留。見圖1。
圖1
半月板觀察
左側示脫細胞前，右側示脫細胞后 a. 大體觀察；b. DAPI染色熒光顯微鏡觀察；c. HE染色；d. 番紅O染色；e. 甲苯胺藍染色；f. 天狼猩紅染色
Figure1. Observation of meniscusLeft indicated before decellularization and right indicated after decellularization a. Gross observation; b. DAPI staining observation under fluorecence microscopy; c. HE staining; d. Safranin O staining; e. Toluidine blue staining; f. Sirius red staining
2.2 新型組織工程半月板支架觀測
2.2.1 大體及掃描電鏡觀察
大體觀察見新型組織工程半月板支架呈交叉網格狀結構，纖維排列整齊。掃描電鏡下可見支架具有明顯縱橫交錯結構，大孔徑（直徑200～300 μm）分布較均勻，纖維徑上微孔相互連接，微孔直徑10～30 μm。見圖2a、b。
圖2
新型組織工程半月板支架觀察
a. 大體觀察；b. 掃描電鏡觀察；c. CCK-8檢測細胞增殖；d. 激光共聚焦顯微鏡下培養1 d（上）及7 d（下）死/活細胞染色觀察 從左至右分別為活細胞染色、死細胞染色及兩者重疊；e. 激光共聚焦顯微鏡觀察培養7 d鬼筆環肽染色觀察；f、g. 大鼠皮下植入后1、3周HE染色觀察
Figure2. Observation of the novel tissue engineered meniscus scaffolda. Gross observation; b. Scanning electron microscopy observation; c. Cell proliferation detected by CCK-8 assay; d. Dead/live cell staining observation after 1 day (upper) and 7 days (bottom) under laser confocal microscope From left to right for live cell staining, dead cell staining, and merge, respectively; e. Cytoskeleton staining observation after 7 days under laser confocal microscopy; f, g. HE staining observation after 1 and 3 weeks after subcutaneous implantation in rats, respectively
2.2.2 細胞相容性觀測
CCK-8檢測示兩組A值均隨時間延長而增加，其中培養3、5 d時實驗組A值大于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2c。死/活細胞染色示，支架上細胞以活細胞為主，細胞活性達90%以上（其中1 d 94%、7 d 95%）（圖2d）。鬼筆環肽染色示培養7 d后支架上細胞呈梭形、分布均勻（圖2e）。
2.2.3 體內植入觀察
支架埋植于大鼠背部皮下HE染色示，1周時可見支架內部和支架與組織交界處炎癥細胞浸潤，支架無明顯降解；3周時未見明顯炎癥細胞浸潤，可見支架有部分降解，支架體積和纖維直徑較植入前減小。見圖2f。
3 討論
近年來，隨著半月板組織工程技術的不斷發展，體外、內半月板替代物研發取得了許多進展[14]。然而，半月板復雜結構和功能以及有限血供使其再生修復依然充滿挑戰[15-16]。半月板再生過程中，支架應具有合適理化特性的結構框架，以幫助宿主細胞黏附和遷移，同時良好的仿生結構可以提供一個良好再生微環境。3D打印技術為構建復雜結構和異質性半月板提供了技術支撐。本研究采用的低溫沉積3D打印技術是近年發展起來的快速成型技術之一，它不僅基于快速沉積制造工藝，而且結合了相分離工藝[17]。采用該技術構建的組織工程支架除了具有可控的大孔徑外，在纖維徑上還具有相互連接的微孔，這些微孔有利于細胞旁分泌，增強細胞生物學功能[18]，在組織工程支架制備和復雜器官設計方面具有廣闊應用前景[19]。
目前，應用于3D生物打印的生物墨水主要分為人工合成材料和天然生物材料[20]。人工合成材料主要有聚羥基乙酸、聚羥基乙酸-聚乳酸復合物、聚乳酸等[21]。它們雖然具有物理機械性能良好、可控性強、微結構可調節等優點，但親水性差、對細胞吸附力弱以及生物相容性不理想。天然生物材料包括海藻酸鈉、明膠、膠原蛋白、殼聚糖、纖維蛋白、透明質酸和脫細胞外基質[22]。其中脫細胞外基質保留了大部分天然成分，無免疫原性，是促進細胞增殖和分化的理想生物材料。既往文獻及本團隊研究顯示脫細胞半月板基質的多孔結構和各種功能分子能決定干細胞分化方向，可能進一步促進半月板再生[23-24]。因此，本研究中我們選擇開發具有可打印性和滿足細胞相容性的脫細胞半月板基質生物墨水，并基于低溫沉積3D打印技術構建結構和成分雙仿生的新型組織工程半月板支架。
研究結果顯示，通過本團隊前期研發的成熟脫細胞技術，成功去除半月板組織中具有免疫原性的核酸組織，并很好地保留了基質生物活性成分，包括黏多糖和多種膠原蛋白[25-26]；制備的脫細胞半月板基質具有可打印性，利用低溫沉積3D打印技術成功構建新型組織工程半月板支架。掃描電鏡觀察示這種新型支架不僅具有縱橫交錯的纖維，類似天然半月板膠原排列，更重要的是纖維徑上形成了直徑10～30 μm 的微孔，為細胞生長提供了黏附位點，也為細胞物質交換、廢物排出提供了通道。既往研究也表明支架多孔結構有助于細胞增殖、分化[27]。本研究CCK-8檢測示隨著時間推移，支架上細胞增殖明顯更快、更多，死/活細胞染色示支架上細胞活性良好，只見少量死細胞，提示構建的支架具有良好細胞相容性。同時，細胞骨架染色示MSCs能很好地在支架上黏附和伸展，并保持干細胞形態。進一步將支架植入大鼠皮下觀察，植入1周有輕度炎癥反應，3周炎癥反應逐漸減輕，并出現支架部分降解。這種早期炎癥反應會募集巨噬細胞，通過調節巨噬細胞極化，促進組織再生修復。
綜上述，本研究成功制備脫細胞半月板基質生物墨水，并利用低溫沉積3D打印技術構建一種具有大孔-微孔分級微觀結構的新型組織工程半月板支架，其能為細胞生長、黏附和增殖提供良好微環境。未來需進一步探討該支架在體外成軟骨分化作用及體內修復損傷半月板組織的效果，為其用于半月板再生修復提供更多數據支持。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經中國人民解放軍總醫院醫學/動物實驗倫理委員會批準（積倫動審字第2023-02-66）；實驗動物使用許可證批準號：SYXK（京）2015-0003
作者貢獻聲明 陳明學：參與研究設計，數據收集、整理、分析，撰寫文章；吳江、殷瀚：參與研究設計，動物實驗，收集實驗原始數據；眭翔：指導研究設計；劉舒云、郭全義：指導研究設計、統籌實驗進度及文章修改
半月板損傷的再生修復目前依然充滿挑戰[1-2]。近年來，隨著再生醫學和組織工程技術的發展，構建組織工程半月板支架實現半月板損傷的再生修復逐漸得到認可[3-4]。理想的半月板組織工程支架應模擬天然半月板空間結構和微環境，有良好細胞相容性，有利于細胞生長和分化，促進損傷半月板的再生和修復[5-6]。脫細胞基質由于具有仿生成分和天然微結構，在組織工程和再生醫學中得到了廣泛應用[7-8]。其最大優點在于良好生物相容性，可很好地模擬細胞生長微環境，有效促進細胞生長和分化。本團隊前期研究發現脫細胞半月板基質可有效促進細胞黏附、增殖和分化，進而促進損傷半月板再生修復，可以作為理想的生物材料[5，9]。
3D打印技術可以實現高度個性化制造，準確制造出具備復雜結構的支架。然而，傳統熔融沉積3D打印技術因打印過程中需要加熱融化材料，故無法用于脫細胞半月板基質打印。近年，低溫沉積3D打印技術的出現為打印該材料提供了可能。該打印技術是在超低溫（?30～?20℃）平臺上逐層搭建支架，經冷凍干燥和相分離技術實現支架高度連通的大孔-微孔結構[10-11]。相對于傳統熔融沉積3D打印技術，其具有以下優勢：① 超低溫下完成打印，可以有效保護材料生物活性；② 能構建具有高度連通的大孔-微孔結構，提高了支架孔隙率，這種分級多孔結構為細胞營養物質交換和擴散提供了通道[12]。
本研究以脫細胞半月板基質為原料，通過低溫沉積3D打印技術構建新型組織工程半月板支架，評價該支架理化特性和生物相容性，為其用于體內修復損傷半月板組織奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
豬新鮮半月板50個，購于北京岳各莊屠宰場。新生48 h 雄性SD大鼠乳鼠10只，體質量12～18 g；8周齡SD大鼠6只，雌雄不限，體質量約250 g；均購自中國人民解放軍總醫院實驗動物中心。
DNA酶、RNA酶、PBS粉、胰蛋白酶（Sigma-Aldrich公司，美國）； DMEM/F12培養基、FBS、青霉素-鏈霉素雙抗（GIBCO公司，美國）；α-MEM培養基（Corning公司，美國）；甲苯胺藍染色試劑盒、HE染色液（北京瀚海拓新生物技術有限公司）；番紅O染色試劑、天狼猩紅染色試劑（北京索萊寶科技有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁公司，日本）；DAPI染液（Molecular Probes公司，美國）；多聚甲醛（北京化學試劑有限公司）；死/活細胞染色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）；鬼筆環肽細胞染色試劑盒（Cytoskeleton公司，美國）。
SUNP BIOMAKER 生物打印機 ［上普博源（北京）生物科技有限公司］；掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；EPOCH TAKE 3 酶標儀（BioTek公司，美國）；激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）；熒光顯微鏡、倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；組織粉碎機（山東九陽股份有限公司）；microCT（GE公司，美國）；Mimics軟件（Materialise公司，比利時）。
1.2 脫細胞半月板基質勻漿制備及觀測
1.2.1 半月板脫細胞方法
參考文獻 ［9，12］ 的改良物理化學聯合方法制備脫細胞半月板基質。具體步驟：將新鮮豬半月板組織切碎，置于10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0）浸泡2 h；置于?80℃冰箱冷凍8 h后取出、室溫下解凍，反復凍融10次；置于37℃ 0.25%胰蛋白酶中，劇烈攪拌24 h，期間每4小時更換1次胰蛋白酶；PBS緩沖液洗滌24 h；DNA酶和RNA酶處理4 h；1%Triton X-100溶液處理24 h；10 mmol/L Tris-HCl緩沖液清洗24 h后，流水持續沖洗3 d以洗去殘余化學試劑。將經上述處理的半月板組織和3倍體積分數的無菌三蒸水放入組織粉碎機內，于4℃反復粉碎30 min；將組織勻漿液進行梯度離心（800×g 離心30 min，取上清；2 500×g離心30 min，取上清；5 000×g離心30 min，取上清；重復以上步驟6次）。最后將收集的上清液以8 000×g離心30 min，收集沉淀即為脫細胞半月板基質勻漿，于4℃條件保存備用。
1.2.2 半月板脫細胞效果觀測
取半月板組織和脫細胞半月板基質勻漿各3個樣本，OCT包埋，冰凍切片，片厚 6 μm；每個樣本取5張切片，4%多聚甲醛固定15 min，蒸餾水洗凈殘留OCT及多聚甲醛后，常規行DAPI及HE染色，分別于熒光顯微鏡和倒置顯微鏡下觀察脫細胞后細胞核殘留情況。另取上述部分冰凍切片復水處理后，參照試劑盒說明行番紅O、甲苯胺藍及天狼猩紅染色，常規脫水封片后于倒置顯微鏡下觀察黏多糖及膠原保留情況。
1.3 新型組織工程半月板支架制備及觀測
1.3.1 脫細胞半月板基質生物墨水制備
將制備的脫細胞半月板基質勻漿置于冷凍干燥機中進行冷凍干燥處理24 h，用組織粉碎機將其打成粉末。取一定質量粉末溶解于5%乙酸中，制備5%（W/V）脫細胞半月板基質生物墨水，調節pH值為7，于4℃條件保存備用。
1.3.2 新型組織工程半月板支架制備
參考本團隊既往構建半月板三維模型方法 ［9］，將前期研究中microCT掃描獲得的兔膝關節半月板影像學數據，以Dicom格式導入Mimics軟件進行半月板三維建模并生成STL文件；將其輸入生物打印機，在G-code文件中規劃打印路徑；參考既往文獻 ［9］ 設置打印參數：生物打印機膠噴頭內徑400 μm、打印速度5 mm/s、絲間距400 μm。打印期間保持打印機注射器溫度約4℃，接收板溫度為–24℃。支架打印后行冷凍干燥24 h，取出后于室溫保存。
1.3.3 大體與掃描電鏡觀察
取制備的新型組織工程半月板支架，大體觀察形態后，經冷凍干燥以及真空噴金處理，掃描電鏡下觀察微觀結構。
1.3.4 支架細胞相容性評價
① 脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）分離培養與傳代：參照文獻 ［13］ 方法進行ADSCs分離、培養和傳代。將10只SD大鼠乳鼠浸泡于75%乙醇溶液處死并消毒，無菌條件下取出雙側腹股溝脂肪墊，置于含青霉素-鏈霉素雙抗的PBS 溶液（pH7.4）中，剪成 1.0～2.0 mm3 碎塊，加入5 mL 0.25%Ⅰ型膠原酶，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中磁力攪拌消化至脂肪顆粒不可見；加入含10%FBS的 DMEM/F12 培養基終止消化，經 100 μm 無菌濾器過濾，以250×g離心 5 min后棄上清液；加入含10% FBS的 DMEM/F12 培養基重懸細胞，移入25 cm2培養瓶，每2天更換1次培養液。待細胞生長至 80%～90% 融合時進行傳代，取第3代細胞進行后續實驗。
② CCK-8 檢測：將新型組織工程半月板支架（0.2 cm×0.2 cm）置于6孔板中，并在支架上接種5 000個ADSCs（實驗組），以平面培養的ADSCs為對照組。于37℃、5%CO2培養箱內培養，待細胞貼壁6 h后加入 DMEM/F12培養基，分別于培養1、3、5 d兩組各取5孔，每孔加入2 mL CCK-8工作液，37℃孵育2 h。每孔吸取100 μL液體轉移至新的96孔板，采用酶標儀檢測450 nm處吸光度（A）值。
③ 死/活細胞染色：取ADSCs接種于新型組織工程半月板支架（2×105個/支架），置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，待細胞貼壁6 h后添加含10%FBS的α-MEM培養基進行培養，每2天更換1次培養基。分別于培養1、7 d使用死/活細胞染色試劑盒對支架上細胞進行染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察，活細胞呈綠色熒光、死細胞呈紅色熒光，按照以下公式計算細胞活性：活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×100%。
④ 鬼筆環肽染色：取ADSCs接種于新型組織工程半月板支架（2×105個/支架）；置于37℃、5%CO2培養箱中孵育7 d。取出后依次以4%多聚甲醛固定30 min、0.3%Triton X-100裂解20 min、免疫封閉液封閉30 min。最后用鬼筆環肽和DAPI對支架上細胞的細胞骨架和細胞核染色，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架鋪展狀態。
1.3.5 體內植入觀察
取6只8周齡SD大鼠，腹腔內注射20 g/L戊巴比妥鈉（30～40 mg/kg）麻醉后，于背部作長約 5 mm切口，切開皮膚、游離皮下組織，然后將大小為1 cm×1 cm的無菌新型組織工程半月板支架植入皮下，每只植入1個支架，縫合切口。術后1、3周各取3只大鼠過量麻醉處死，按照原切口入路取材。將樣本置于40 g/L 多聚甲醛固定30 min，石蠟包埋切片，片厚6 μm，常規HE染色，倒置顯微鏡下觀察炎癥細胞浸潤與支架降解情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS和GraphPad Prism 9.0統計軟件進行分析。計量資料采用Shapiro-Wilk檢驗行正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 半月板脫細胞效果觀察
大體觀察半月板組織呈半月形或C形，脫細胞前呈乳白色纖維軟骨樣組織，質地柔軟、有彈性；脫細胞半月板基質呈透明凝膠狀。DAPI及HE染色示，脫細胞前半月板有大量細胞核結構，脫細胞處理后半月板基質未見細胞核結構，表明具有免疫原性的核酸組織徹底去除。番紅O、甲苯胺藍及天狼猩紅染色示，脫細胞前后均呈陽性，提示脫細胞過程中黏多糖和膠原成分保留。見圖1。
圖1
半月板觀察
左側示脫細胞前，右側示脫細胞后 a. 大體觀察；b. DAPI染色熒光顯微鏡觀察；c. HE染色；d. 番紅O染色；e. 甲苯胺藍染色；f. 天狼猩紅染色
Figure1. Observation of meniscusLeft indicated before decellularization and right indicated after decellularization a. Gross observation; b. DAPI staining observation under fluorecence microscopy; c. HE staining; d. Safranin O staining; e. Toluidine blue staining; f. Sirius red staining
2.2 新型組織工程半月板支架觀測
2.2.1 大體及掃描電鏡觀察
大體觀察見新型組織工程半月板支架呈交叉網格狀結構，纖維排列整齊。掃描電鏡下可見支架具有明顯縱橫交錯結構，大孔徑（直徑200～300 μm）分布較均勻，纖維徑上微孔相互連接，微孔直徑10～30 μm。見圖2a、b。
圖2
新型組織工程半月板支架觀察
a. 大體觀察；b. 掃描電鏡觀察；c. CCK-8檢測細胞增殖；d. 激光共聚焦顯微鏡下培養1 d（上）及7 d（下）死/活細胞染色觀察 從左至右分別為活細胞染色、死細胞染色及兩者重疊；e. 激光共聚焦顯微鏡觀察培養7 d鬼筆環肽染色觀察；f、g. 大鼠皮下植入后1、3周HE染色觀察
Figure2. Observation of the novel tissue engineered meniscus scaffolda. Gross observation; b. Scanning electron microscopy observation; c. Cell proliferation detected by CCK-8 assay; d. Dead/live cell staining observation after 1 day (upper) and 7 days (bottom) under laser confocal microscope From left to right for live cell staining, dead cell staining, and merge, respectively; e. Cytoskeleton staining observation after 7 days under laser confocal microscopy; f, g. HE staining observation after 1 and 3 weeks after subcutaneous implantation in rats, respectively
2.2.2 細胞相容性觀測
CCK-8檢測示兩組A值均隨時間延長而增加，其中培養3、5 d時實驗組A值大于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2c。死/活細胞染色示，支架上細胞以活細胞為主，細胞活性達90%以上（其中1 d 94%、7 d 95%）（圖2d）。鬼筆環肽染色示培養7 d后支架上細胞呈梭形、分布均勻（圖2e）。
2.2.3 體內植入觀察
支架埋植于大鼠背部皮下HE染色示，1周時可見支架內部和支架與組織交界處炎癥細胞浸潤，支架無明顯降解；3周時未見明顯炎癥細胞浸潤，可見支架有部分降解，支架體積和纖維直徑較植入前減小。見圖2f。
3 討論
近年來，隨著半月板組織工程技術的不斷發展，體外、內半月板替代物研發取得了許多進展[14]。然而，半月板復雜結構和功能以及有限血供使其再生修復依然充滿挑戰[15-16]。半月板再生過程中，支架應具有合適理化特性的結構框架，以幫助宿主細胞黏附和遷移，同時良好的仿生結構可以提供一個良好再生微環境。3D打印技術為構建復雜結構和異質性半月板提供了技術支撐。本研究采用的低溫沉積3D打印技術是近年發展起來的快速成型技術之一，它不僅基于快速沉積制造工藝，而且結合了相分離工藝[17]。采用該技術構建的組織工程支架除了具有可控的大孔徑外，在纖維徑上還具有相互連接的微孔，這些微孔有利于細胞旁分泌，增強細胞生物學功能[18]，在組織工程支架制備和復雜器官設計方面具有廣闊應用前景[19]。
目前，應用于3D生物打印的生物墨水主要分為人工合成材料和天然生物材料[20]。人工合成材料主要有聚羥基乙酸、聚羥基乙酸-聚乳酸復合物、聚乳酸等[21]。它們雖然具有物理機械性能良好、可控性強、微結構可調節等優點，但親水性差、對細胞吸附力弱以及生物相容性不理想。天然生物材料包括海藻酸鈉、明膠、膠原蛋白、殼聚糖、纖維蛋白、透明質酸和脫細胞外基質[22]。其中脫細胞外基質保留了大部分天然成分，無免疫原性，是促進細胞增殖和分化的理想生物材料。既往文獻及本團隊研究顯示脫細胞半月板基質的多孔結構和各種功能分子能決定干細胞分化方向，可能進一步促進半月板再生[23-24]。因此，本研究中我們選擇開發具有可打印性和滿足細胞相容性的脫細胞半月板基質生物墨水，并基于低溫沉積3D打印技術構建結構和成分雙仿生的新型組織工程半月板支架。
研究結果顯示，通過本團隊前期研發的成熟脫細胞技術，成功去除半月板組織中具有免疫原性的核酸組織，并很好地保留了基質生物活性成分，包括黏多糖和多種膠原蛋白[25-26]；制備的脫細胞半月板基質具有可打印性，利用低溫沉積3D打印技術成功構建新型組織工程半月板支架。掃描電鏡觀察示這種新型支架不僅具有縱橫交錯的纖維，類似天然半月板膠原排列，更重要的是纖維徑上形成了直徑10～30 μm 的微孔，為細胞生長提供了黏附位點，也為細胞物質交換、廢物排出提供了通道。既往研究也表明支架多孔結構有助于細胞增殖、分化[27]。本研究CCK-8檢測示隨著時間推移，支架上細胞增殖明顯更快、更多，死/活細胞染色示支架上細胞活性良好，只見少量死細胞，提示構建的支架具有良好細胞相容性。同時，細胞骨架染色示MSCs能很好地在支架上黏附和伸展，并保持干細胞形態。進一步將支架植入大鼠皮下觀察，植入1周有輕度炎癥反應，3周炎癥反應逐漸減輕，并出現支架部分降解。這種早期炎癥反應會募集巨噬細胞，通過調節巨噬細胞極化，促進組織再生修復。
綜上述，本研究成功制備脫細胞半月板基質生物墨水，并利用低溫沉積3D打印技術構建一種具有大孔-微孔分級微觀結構的新型組織工程半月板支架，其能為細胞生長、黏附和增殖提供良好微環境。未來需進一步探討該支架在體外成軟骨分化作用及體內修復損傷半月板組織的效果，為其用于半月板再生修復提供更多數據支持。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經中國人民解放軍總醫院醫學/動物實驗倫理委員會批準（積倫動審字第2023-02-66）；實驗動物使用許可證批準號：SYXK（京）2015-0003
作者貢獻聲明 陳明學：參與研究設計，數據收集、整理、分析，撰寫文章；吳江、殷瀚：參與研究設計，動物實驗，收集實驗原始數據；眭翔：指導研究設計；劉舒云、郭全義：指導研究設計、統籌實驗進度及文章修改
