引用本文： 趙塞, 董圓, 石林, 張晨, 邵子琪, 趙益明, 王建. 結直腸癌患者血漿可溶性平足蛋白的檢測及臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2024, 31(5): 579-584. doi: 10.7507/1007-9424.202310091 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國普外基礎與臨床雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
結直腸癌（coloretal cancer，CRC）為人類最常見的消化道惡性腫瘤，在全球范圍內其發病率居于惡性腫瘤第3位，死亡率居于惡性腫瘤第2位[1]。CRC發病隱蔽，初期臨床癥狀不明顯，多數CRC患者在診斷時已經到了中晚期，所以CRC的早期診斷非常重要，必須做到早發現、早診治以控制疾病發生發展。當前CRC的檢測手段主要有影像學、脫落細胞學、血液腫瘤標志物及組織病理學，其中組織病理學是其診斷金標準，但組織病理獲取需依靠消化內鏡，其為有創性檢查，流程復雜；因此，臨床上迫切需要尋找新的腫瘤標志物對CRC患者的臨床分期作出準確的判斷。
平足蛋白（podoplanin，PDPN）屬于Ⅰ型唾液酸跨膜糖蛋白，在多種腫瘤細胞中表達上調，主要表達在淋巴內皮上[2]，在淋巴管的發生中扮演著重要角色[3-4]。除了正常組織和細胞外，PDPN也存在于人類炎癥性疾病[5-6]和各種癌癥組織[7]，例如乳腺癌[8]、惡性黑色素瘤[9]、腦腫瘤[10]、胰腺癌[11]、子宮內膜癌[12]等。此外，PDPN與血小板表面的Ｃ型凝集素樣受體２（C-type lectin-like receptor-2，CLEC-2）相互作用后誘導血小板活化聚集。另外研究[1]發現，凡表達PDPN蛋白的細胞（內源或者轉染）都可釋放出表達PDPN蛋白的mRNA囊泡，可溶性平足蛋白（plasma soluble podoplanin，sPDPN）可通過外環境外泌體及細胞內多泡體釋放至患者血漿中[13]。研究[14-15]結果表明PDPN與腫瘤的生長、侵襲、轉移等息息相關。本研究應用趙益明教授團隊提供的小鼠抗人PDPN單克隆抗體SZ-163和SZ-168，并通過酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測血漿中sPDPN的表達水平，旨在探討血漿sPDPN在CRC患者中的表達及其臨床意義。
1 資料和方法
1.1 研究數據集和研究對象
1.1.1 研究數據集
從UCSCxena數據庫獲取TCGA-READ、TCGA-COAD的數據集 ［log2（FPKM+1）］。本研究關注的基因為PDPN。
1.1.2 研究對象
CRC患者納入標準：所有入組患者均經組織病理學診斷為CRC；采血前未接受手術、放療、化療等抗腫瘤治療；CRC分期根據國際癌癥控制聯盟（International Union Against Cancer，UICC）公布的 TNM 分標準確定。排除標準：接受手術或放化療等抗腫瘤治療、急慢性炎癥、其他惡性腫瘤史、獲得性免疫缺陷綜合征或梅毒等病毒感染性疾病。本研究通過徐州醫科大學第二附屬醫院倫理委員會批準。回顧性收集2020年11月至2022年12月期間于徐州醫科大學第二附屬醫院普外科接受手術的CRC患者85例（CRC組），收集患者的一般臨床資料，包括患者的年齡、性別、病理診斷、臨床分期、腫瘤標志物等。其中男43例，女42例；年齡為32～91歲，中位年齡為66歲；Ⅰ期12例，Ⅱ期37例，Ⅲ期30例，Ⅳ期6例；G1 33例，G2 34例，G3 18例；T1期1例，T2期16例，T3期55例，T4期13例；N0期49例，N1期22例，N2期14例；遠處轉移7例。
另收集同期來院體檢的100例健康自愿者作為對照組，收集其一般臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤標志物等。其中男48例，女52例；年齡36～81歲，中位年齡為60歲。2組的性別、年齡等一般資料比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
1.2 方法
1.2.1 數據來源
從UCSCxena數據庫獲取TCGA-READ和TCGA-COAD的數據集。TCGA-COAD數據集包含512個樣本，其中腫瘤樣本471個，癌旁組織樣本41例。TCGA-READ數據集包含177個樣本，其中腫瘤樣本167個，癌旁組織樣本10個。分析中將LUAD、LUSC的數據集合并作為CRC數據集，并將數據集轉換為TPM數據，包含689個樣本，其中腫瘤樣本638個，癌旁組織樣本51個。
1.2.2 臨床標本采集及處理
于患者入徐州醫科大學第二附屬醫院普外科后、手術前1周內用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA-K2）抗凝真空采血管清晨采集患者空腹靜脈血2 mL，體檢健康自愿者同樣于清晨采集空腹靜脈血2 mL。采血完畢后輕微顛倒采血管，使血液與抗凝劑充分混合，最后將樣本放置于4 ℃冰箱保存，6 h內在離心機中離心（1 150 g 離心10 min），離心完畢后可見上層為淡黃色的血清，若離心不完全，需重復離心1遍，吸取上層血清并分裝，–80 ℃冰箱保存待測。
1.2.3 儀器與試劑
SpectraMax多功能酶標儀（M2）系美國Molecular Devices公司產品，單克隆抗體SZ-163和SZ-168由蘇州大學附屬第一醫院趙益明教授團隊提供。
1.2.4 檢測外周靜脈血標本中sPDPN的含量
① 包板。將SZ-163-8C12-3抗體以pH=9.5的碳酸鹽緩沖液稀釋至2 μg/mL，100 μL/孔包板，4 ℃冰箱過夜。次日甩去孔內液體，用0.05% PBST（0.1%吐溫 PBS 緩沖液）洗滌5次，拍干。② 封閉。用5%脫脂奶粉、200 μL/孔，4 ℃封閉過夜。次日甩去孔內液體，同上用0.05% PBST洗滌5次，拍干。③ 上樣。用5%脫脂奶粉稀釋重組人PDPN全長多肽至200 ng/mL，再進行倍比稀釋直至1.562 5 ng/mL，共8個濃度作為標準曲線。以5%脫脂奶粉作為陰性對照，以0.05% PBST作為空白對照，100 μL/孔上樣。血漿樣品不需要稀釋，直接100 μL/孔上樣。將酶標板置于37 ℃水浴箱內孵育2 h。隨后棄去孔內液體，0.05% PBST洗滌5次，拍干。④ 二抗。用5%脫脂奶粉稀釋SZ-168-HRP至1∶2 000，100 μL/孔、37 ℃水浴箱孵育1 h。隨后棄去孔內液體，0.05% PBST洗滌5次，拍干。⑤ 顯色。稱取10 mg鄰苯二胺（o-phenylene diamine，OPD）干粉，加入2 mL 5×OPD緩沖液、8 mL去離子水，置于37 ℃水浴箱加速溶解，臨用時加入10 mL 30%過氧化氫溶液。每孔加入100 mL OPD顯色液，避光37 ℃顯色10 min后，用終止緩沖液終止反應（50 μL/孔）。⑥ 上機。酶標儀讀取492 nm處的吸光度值（A值）。⑦ 標準曲線的繪制。以重組人PDPN嵌合體作為標準品，以200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 ng/mL的濃度稀釋度為橫坐標，相應在450 nm波長處的A 值作為縱坐標，作半對數回歸方程擬合，計算出對應待測樣本的濃度，R2=0.991 2 ［y=0.232 3Ln（x）+0.234 3）］，其中y是A值，x是濃度。
1.3 統計學方法
通過SPSS 25.0軟件和R軟件包（R-4.2.2版）對數據進行統計分析。使用R軟件中的“ggpubr”包繪制CRC和癌旁組織/配對癌旁組織中PDPN表達水平的箱式圖，統計比較采用成組Z檢驗或者配對t檢驗。血漿sPDPN的表達數據服從正態分布，用均數±標準差（
±s）表示，統計方法采用獨立樣本比較的t檢驗。使用R軟件的“survival”包繪制生存曲線，且通過log-rank檢驗進行生存曲線的比較。采用受試者工作曲線（receiver operating characteristics，ROC）評估sPDPN等對CRC的診斷價值。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 TCGA數據集中PDPN的表達差異分析
由CRC和癌旁組織中PDPN mRNA表達的箱式圖，以及CRC及其配對癌旁組織中PDPN mRNA表達水平的箱式圖（圖1a和1b）可見，PDPN mRNA在CRC組織中表達上調（P<0.001）。
圖1
示TCGA數據集中PDPN mRNA表達組間差異箱式圖及高表達和低表達PDPN mRNA患者的生存曲線
a：CRC組織與癌旁組織比較；b：CRC組織與其配對癌旁組織比較；c：高表達和低表達PDPN mRNA患者的生存曲線
2.2 TCGA數據集中PNPD表達和患者預后的關系
638個CRC樣本中共有613個樣本存在生存信息（去除生存時間短于30 d的樣本），使用R軟件“surviver”包自帶的最佳閾值包計算PDPN mRNA表達水平的最佳閾值，據此分為高表達組480例和低表達組133例，結果高表達組患者的預后優于低表達組患者（χ2=12.97，P=0.045），見圖1c。
2.3 sPDPN在CRC患者血漿中高表達
采用ELISA檢測CRC組和對照組研究對象血漿中sPDPN的表達，結果CRC組sPDPN的表達水平為（3.50±1.77）ng/mL，對照組為（1.95±0.46）ng/mL，CRC組較高（P<0.01），提示sPDPN在CRC患者血漿中表達水平上調。
2.4 CRC患者中血漿sPDPN表達水平與臨床病理特征的關系
臨床分期Ⅲ+Ⅳ期患者的sPDPN表達水平高于Ⅰ+Ⅱ期者（P=0.026），N1～2期患者的sPDPN表達水平高于N0期者（P=0.049），但sPDPN的表達水平與性別、年齡、分化程度、T分期和M分期的關系無統計學意義（P>0.05）。見表1。
表1
CRC患者血漿中的sPDPN表達水平與其臨床病理特征的關系（x±s）
2.5 ROC曲線分析sPDPN的診斷價值
繪制sPNPD、糖類抗原199（carbohydrate antigen 199，CA199）和癌胚抗原（carcinogenicity antigen，CEA）預測CRC的ROC曲線并計算曲線下面積（area under curve，AUC），結果見圖2與表2，sPDPN與其他腫瘤標志物相比AUC值最高，當截斷值為2.555 ng/mL時，sPDPN的靈敏度為72.9%，特異性為98.2%。
圖2
示sPDPN、CA199和CEA診斷CRC的ROC曲線
表2
不同腫瘤標志物對CRC的診斷效能比較
2.6 sPDPN對CRC的預測價值
以是否患CRC為響應變量（0為健康對照，1為CRC），以性別、年齡、sPDPN表達水平、CEA水平和CA199水平為自變量，先進行單因素logistic回歸分析，結合單因素回歸分析結果P<0.05的因素和專業認知選擇自變量進行多因素logistic回歸分析。結果表明，sPDPN表達水平高為CRC的預測因素 ［OR=14.769，95%CI（5.867，37.174），P<0.001］，見表3。
表3
CRC預測因素的logistic回歸分析結果
3 討論
CRC是消化系統中最常見的惡性腫瘤，也是常見的死亡原因。腫瘤的生長和轉移是一個涉及多重機制的復雜過程，其中血小板參與腫瘤的生長和轉移[16-17]。PDPN在多數腫瘤細胞中表達上調，血小板表面的CLEC-2被認為是PDPN的內源性受體，腫瘤細胞表達的PDPN通過與CLEC-2結合，誘導血小板聚集，促進腫瘤的轉移[18]。活化后的血小板能夠分泌凝血因子、血管活性物質、細胞因子酶等一系列物質并促進白細胞尤其是中性粒細胞的聚集以及活化，加速炎癥反應的進展[19]，同時表達PDPN的細胞也將其以可溶的形式sPDPN釋放到患者血漿中。此外也有研究[19]發現Ezrin和膜蛋白屬于ERM（Ezrin、放射蛋白和膜蛋白）蛋白家族，可以與PDPN的胞質結構域結合，重新排列肌動蛋白細胞骨架，參與淋巴管生成、淋巴結轉移和上皮間質轉化，并在腫瘤轉移中發揮了重要的作用。Parhar等[20]檢測了膀胱癌患者血清和尿液中sPDPN的水平后認為：膀胱腺癌患者血清和尿液中PDPN的含量均比正常人高，并且分化程度越高，伴有多發病灶以及惡性程度越高的患者，其sPDPN的表達水平也越高，從而表明sPDPN與患者預后存在相關性。
本研究首先從TCGA數據集中提取CRC患者的PDPN mRNA表達數據，探討了PDPN mRNA在CRC組織中的表達及與預后的關系。結果顯示，PDPN mRNA在CRC組織中表達上調（P<0.05）；生存分析結果顯示，以最佳閾值劃分的高低表達組中，高表達組患者的預后差于低表達組，提示PDPN是CRC潛在的腫瘤標志物。Carrasco-Ramírez等[21]報道，異位或內源性表達 PDPN 的細胞會釋放含有 PDPN mRNA 及其蛋白的膜脫落微囊泡（microvesicles，MV）和內體衍生的外泌體（exosome，EXO），PDPN 對 EXO 及 MV 的生成或釋放，PDPN-EXO 對腫瘤的發生起著至關重要的作用。進而筆者團隊應用趙益明教授團隊提供的小鼠抗人PDPN單克隆抗體SZ-168和SZ-163，聯合ELISA方法檢測CRC患者手術前血漿中sPDPN的表達水平，并與正常人群做對比，結果發現，CRC組的sPDPN表達水平高于對照組 ［（3.50±1.77）ng/mL vs. （1.95±0.46）ng/mL，P<0.01］，表明CRC患者血漿中sPDPN的表達水平增高，通過檢測患者外周靜脈血中sPDPN的含量有利于輔助臨床診斷。
sPDPN作為一種腫瘤標志物，在CRC的診療中有一定的應用價值。許多研究[22-25]表明PDPN的表達與腫瘤的惡性程度、侵襲性及轉移性有關，從而導致腫瘤進展與預后不良。本研究探索了CRC患者血漿sPDPN表達水平和臨床病理特征之間的關系，結果顯示臨床分期Ⅲ+Ⅳ期CRC患者的sPDPN表達水平高于Ⅰ+Ⅱ期者（P=0.026），N1～2期患者的sPDPN表達水平高于N0期者（P=0.049），但sPDPN的表達水平與性別、年齡、分化程度、T分期和M分期的關系無統計學意義（P>0.05），提示PDPN作為淋巴管內皮細胞的特異性標志物，sPDPN的含量與淋巴結轉移有關，sPDPN含量越高顯示患者淋巴結轉移風險越高，sPDPN可能是評估CRC患者臨床分期和轉移情況的指標。
sPDPN可作為CRC潛在的腫瘤標志物，為了評估sPDPN對CRC的預測價值，本研究將sPDPN的診斷效能與胃腸道其他腫瘤標志物如CA199、CEA進行比較，結果顯示：與CA199和CEA相比，sPDPN對CRC患者的診斷價值最高（AUC=0.882），當截斷值值為2.555 ng/mL時，靈敏度為72.9%，特異度為98.2%，這表明與其他腫瘤標志物相比sPDPN對CRC有著較高的診斷價值，可以作為一項腫瘤標志物來輔助臨床診斷，且與檢測組織PDPN蛋白、mRNA表達相比，更容易操作，患者的依從性更高。
綜上所述，CRC患者血漿中sPDPN的表達水平高于健康自愿者，且sPDPN的表達與患者的臨床分期和淋巴結轉移有關，對CRC的診斷、臨床分期和淋巴結轉移評估有一定的臨床應用價值。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：趙塞，設計試驗，實施研究、采集數據和分析解釋數據，起草文章；董圓、石林、張晨、邵子琪，實施研究和采集數據；趙益明，設計試驗，對文章的知識性內容作批評性審閱，具有支持性貢獻；王建，指導研究、設計試驗，實施研究、統計分析和解釋數據，對文章的知識性內容作批評性審閱。。
倫理聲明：本研究已通過徐州醫科大學第二附屬醫院的倫理審核批準，批文編號為：［2020］080401。
結直腸癌（coloretal cancer，CRC）為人類最常見的消化道惡性腫瘤，在全球范圍內其發病率居于惡性腫瘤第3位，死亡率居于惡性腫瘤第2位[1]。CRC發病隱蔽，初期臨床癥狀不明顯，多數CRC患者在診斷時已經到了中晚期，所以CRC的早期診斷非常重要，必須做到早發現、早診治以控制疾病發生發展。當前CRC的檢測手段主要有影像學、脫落細胞學、血液腫瘤標志物及組織病理學，其中組織病理學是其診斷金標準，但組織病理獲取需依靠消化內鏡，其為有創性檢查，流程復雜；因此，臨床上迫切需要尋找新的腫瘤標志物對CRC患者的臨床分期作出準確的判斷。
平足蛋白（podoplanin，PDPN）屬于Ⅰ型唾液酸跨膜糖蛋白，在多種腫瘤細胞中表達上調，主要表達在淋巴內皮上[2]，在淋巴管的發生中扮演著重要角色[3-4]。除了正常組織和細胞外，PDPN也存在于人類炎癥性疾病[5-6]和各種癌癥組織[7]，例如乳腺癌[8]、惡性黑色素瘤[9]、腦腫瘤[10]、胰腺癌[11]、子宮內膜癌[12]等。此外，PDPN與血小板表面的Ｃ型凝集素樣受體２（C-type lectin-like receptor-2，CLEC-2）相互作用后誘導血小板活化聚集。另外研究[1]發現，凡表達PDPN蛋白的細胞（內源或者轉染）都可釋放出表達PDPN蛋白的mRNA囊泡，可溶性平足蛋白（plasma soluble podoplanin，sPDPN）可通過外環境外泌體及細胞內多泡體釋放至患者血漿中[13]。研究[14-15]結果表明PDPN與腫瘤的生長、侵襲、轉移等息息相關。本研究應用趙益明教授團隊提供的小鼠抗人PDPN單克隆抗體SZ-163和SZ-168，并通過酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測血漿中sPDPN的表達水平，旨在探討血漿sPDPN在CRC患者中的表達及其臨床意義。
1 資料和方法
1.1 研究數據集和研究對象
1.1.1 研究數據集
從UCSCxena數據庫獲取TCGA-READ、TCGA-COAD的數據集 ［log2（FPKM+1）］。本研究關注的基因為PDPN。
1.1.2 研究對象
CRC患者納入標準：所有入組患者均經組織病理學診斷為CRC；采血前未接受手術、放療、化療等抗腫瘤治療；CRC分期根據國際癌癥控制聯盟（International Union Against Cancer，UICC）公布的 TNM 分標準確定。排除標準：接受手術或放化療等抗腫瘤治療、急慢性炎癥、其他惡性腫瘤史、獲得性免疫缺陷綜合征或梅毒等病毒感染性疾病。本研究通過徐州醫科大學第二附屬醫院倫理委員會批準。回顧性收集2020年11月至2022年12月期間于徐州醫科大學第二附屬醫院普外科接受手術的CRC患者85例（CRC組），收集患者的一般臨床資料，包括患者的年齡、性別、病理診斷、臨床分期、腫瘤標志物等。其中男43例，女42例；年齡為32～91歲，中位年齡為66歲；Ⅰ期12例，Ⅱ期37例，Ⅲ期30例，Ⅳ期6例；G1 33例，G2 34例，G3 18例；T1期1例，T2期16例，T3期55例，T4期13例；N0期49例，N1期22例，N2期14例；遠處轉移7例。
另收集同期來院體檢的100例健康自愿者作為對照組，收集其一般臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤標志物等。其中男48例，女52例；年齡36～81歲，中位年齡為60歲。2組的性別、年齡等一般資料比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
1.2 方法
1.2.1 數據來源
從UCSCxena數據庫獲取TCGA-READ和TCGA-COAD的數據集。TCGA-COAD數據集包含512個樣本，其中腫瘤樣本471個，癌旁組織樣本41例。TCGA-READ數據集包含177個樣本，其中腫瘤樣本167個，癌旁組織樣本10個。分析中將LUAD、LUSC的數據集合并作為CRC數據集，并將數據集轉換為TPM數據，包含689個樣本，其中腫瘤樣本638個，癌旁組織樣本51個。
1.2.2 臨床標本采集及處理
于患者入徐州醫科大學第二附屬醫院普外科后、手術前1周內用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA-K2）抗凝真空采血管清晨采集患者空腹靜脈血2 mL，體檢健康自愿者同樣于清晨采集空腹靜脈血2 mL。采血完畢后輕微顛倒采血管，使血液與抗凝劑充分混合，最后將樣本放置于4 ℃冰箱保存，6 h內在離心機中離心（1 150 g 離心10 min），離心完畢后可見上層為淡黃色的血清，若離心不完全，需重復離心1遍，吸取上層血清并分裝，–80 ℃冰箱保存待測。
1.2.3 儀器與試劑
SpectraMax多功能酶標儀（M2）系美國Molecular Devices公司產品，單克隆抗體SZ-163和SZ-168由蘇州大學附屬第一醫院趙益明教授團隊提供。
1.2.4 檢測外周靜脈血標本中sPDPN的含量
① 包板。將SZ-163-8C12-3抗體以pH=9.5的碳酸鹽緩沖液稀釋至2 μg/mL，100 μL/孔包板，4 ℃冰箱過夜。次日甩去孔內液體，用0.05% PBST（0.1%吐溫 PBS 緩沖液）洗滌5次，拍干。② 封閉。用5%脫脂奶粉、200 μL/孔，4 ℃封閉過夜。次日甩去孔內液體，同上用0.05% PBST洗滌5次，拍干。③ 上樣。用5%脫脂奶粉稀釋重組人PDPN全長多肽至200 ng/mL，再進行倍比稀釋直至1.562 5 ng/mL，共8個濃度作為標準曲線。以5%脫脂奶粉作為陰性對照，以0.05% PBST作為空白對照，100 μL/孔上樣。血漿樣品不需要稀釋，直接100 μL/孔上樣。將酶標板置于37 ℃水浴箱內孵育2 h。隨后棄去孔內液體，0.05% PBST洗滌5次，拍干。④ 二抗。用5%脫脂奶粉稀釋SZ-168-HRP至1∶2 000，100 μL/孔、37 ℃水浴箱孵育1 h。隨后棄去孔內液體，0.05% PBST洗滌5次，拍干。⑤ 顯色。稱取10 mg鄰苯二胺（o-phenylene diamine，OPD）干粉，加入2 mL 5×OPD緩沖液、8 mL去離子水，置于37 ℃水浴箱加速溶解，臨用時加入10 mL 30%過氧化氫溶液。每孔加入100 mL OPD顯色液，避光37 ℃顯色10 min后，用終止緩沖液終止反應（50 μL/孔）。⑥ 上機。酶標儀讀取492 nm處的吸光度值（A值）。⑦ 標準曲線的繪制。以重組人PDPN嵌合體作為標準品，以200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 ng/mL的濃度稀釋度為橫坐標，相應在450 nm波長處的A 值作為縱坐標，作半對數回歸方程擬合，計算出對應待測樣本的濃度，R2=0.991 2 ［y=0.232 3Ln（x）+0.234 3）］，其中y是A值，x是濃度。
1.3 統計學方法
通過SPSS 25.0軟件和R軟件包（R-4.2.2版）對數據進行統計分析。使用R軟件中的“ggpubr”包繪制CRC和癌旁組織/配對癌旁組織中PDPN表達水平的箱式圖，統計比較采用成組Z檢驗或者配對t檢驗。血漿sPDPN的表達數據服從正態分布，用均數±標準差（±s）表示，統計方法采用獨立樣本比較的t檢驗。使用R軟件的“survival”包繪制生存曲線，且通過log-rank檢驗進行生存曲線的比較。采用受試者工作曲線（receiver operating characteristics，ROC）評估sPDPN等對CRC的診斷價值。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 TCGA數據集中PDPN的表達差異分析
由CRC和癌旁組織中PDPN mRNA表達的箱式圖，以及CRC及其配對癌旁組織中PDPN mRNA表達水平的箱式圖（圖1a和1b）可見，PDPN mRNA在CRC組織中表達上調（P<0.001）。
圖1
示TCGA數據集中PDPN mRNA表達組間差異箱式圖及高表達和低表達PDPN mRNA患者的生存曲線
a：CRC組織與癌旁組織比較；b：CRC組織與其配對癌旁組織比較；c：高表達和低表達PDPN mRNA患者的生存曲線
2.2 TCGA數據集中PNPD表達和患者預后的關系
638個CRC樣本中共有613個樣本存在生存信息（去除生存時間短于30 d的樣本），使用R軟件“surviver”包自帶的最佳閾值包計算PDPN mRNA表達水平的最佳閾值，據此分為高表達組480例和低表達組133例，結果高表達組患者的預后優于低表達組患者（χ2=12.97，P=0.045），見圖1c。
2.3 sPDPN在CRC患者血漿中高表達
采用ELISA檢測CRC組和對照組研究對象血漿中sPDPN的表達，結果CRC組sPDPN的表達水平為（3.50±1.77）ng/mL，對照組為（1.95±0.46）ng/mL，CRC組較高（P<0.01），提示sPDPN在CRC患者血漿中表達水平上調。
2.4 CRC患者中血漿sPDPN表達水平與臨床病理特征的關系
臨床分期Ⅲ+Ⅳ期患者的sPDPN表達水平高于Ⅰ+Ⅱ期者（P=0.026），N1～2期患者的sPDPN表達水平高于N0期者（P=0.049），但sPDPN的表達水平與性別、年齡、分化程度、T分期和M分期的關系無統計學意義（P>0.05）。見表1。
表1
CRC患者血漿中的sPDPN表達水平與其臨床病理特征的關系（x±s）
2.5 ROC曲線分析sPDPN的診斷價值
繪制sPNPD、糖類抗原199（carbohydrate antigen 199，CA199）和癌胚抗原（carcinogenicity antigen，CEA）預測CRC的ROC曲線并計算曲線下面積（area under curve，AUC），結果見圖2與表2，sPDPN與其他腫瘤標志物相比AUC值最高，當截斷值為2.555 ng/mL時，sPDPN的靈敏度為72.9%，特異性為98.2%。
圖2
示sPDPN、CA199和CEA診斷CRC的ROC曲線
表2
不同腫瘤標志物對CRC的診斷效能比較
2.6 sPDPN對CRC的預測價值
以是否患CRC為響應變量（0為健康對照，1為CRC），以性別、年齡、sPDPN表達水平、CEA水平和CA199水平為自變量，先進行單因素logistic回歸分析，結合單因素回歸分析結果P<0.05的因素和專業認知選擇自變量進行多因素logistic回歸分析。結果表明，sPDPN表達水平高為CRC的預測因素 ［OR=14.769，95%CI（5.867，37.174），P<0.001］，見表3。
表3
CRC預測因素的logistic回歸分析結果
3 討論
CRC是消化系統中最常見的惡性腫瘤，也是常見的死亡原因。腫瘤的生長和轉移是一個涉及多重機制的復雜過程，其中血小板參與腫瘤的生長和轉移[16-17]。PDPN在多數腫瘤細胞中表達上調，血小板表面的CLEC-2被認為是PDPN的內源性受體，腫瘤細胞表達的PDPN通過與CLEC-2結合，誘導血小板聚集，促進腫瘤的轉移[18]。活化后的血小板能夠分泌凝血因子、血管活性物質、細胞因子酶等一系列物質并促進白細胞尤其是中性粒細胞的聚集以及活化，加速炎癥反應的進展[19]，同時表達PDPN的細胞也將其以可溶的形式sPDPN釋放到患者血漿中。此外也有研究[19]發現Ezrin和膜蛋白屬于ERM（Ezrin、放射蛋白和膜蛋白）蛋白家族，可以與PDPN的胞質結構域結合，重新排列肌動蛋白細胞骨架，參與淋巴管生成、淋巴結轉移和上皮間質轉化，并在腫瘤轉移中發揮了重要的作用。Parhar等[20]檢測了膀胱癌患者血清和尿液中sPDPN的水平后認為：膀胱腺癌患者血清和尿液中PDPN的含量均比正常人高，并且分化程度越高，伴有多發病灶以及惡性程度越高的患者，其sPDPN的表達水平也越高，從而表明sPDPN與患者預后存在相關性。
本研究首先從TCGA數據集中提取CRC患者的PDPN mRNA表達數據，探討了PDPN mRNA在CRC組織中的表達及與預后的關系。結果顯示，PDPN mRNA在CRC組織中表達上調（P<0.05）；生存分析結果顯示，以最佳閾值劃分的高低表達組中，高表達組患者的預后差于低表達組，提示PDPN是CRC潛在的腫瘤標志物。Carrasco-Ramírez等[21]報道，異位或內源性表達 PDPN 的細胞會釋放含有 PDPN mRNA 及其蛋白的膜脫落微囊泡（microvesicles，MV）和內體衍生的外泌體（exosome，EXO），PDPN 對 EXO 及 MV 的生成或釋放，PDPN-EXO 對腫瘤的發生起著至關重要的作用。進而筆者團隊應用趙益明教授團隊提供的小鼠抗人PDPN單克隆抗體SZ-168和SZ-163，聯合ELISA方法檢測CRC患者手術前血漿中sPDPN的表達水平，并與正常人群做對比，結果發現，CRC組的sPDPN表達水平高于對照組 ［（3.50±1.77）ng/mL vs. （1.95±0.46）ng/mL，P<0.01］，表明CRC患者血漿中sPDPN的表達水平增高，通過檢測患者外周靜脈血中sPDPN的含量有利于輔助臨床診斷。
sPDPN作為一種腫瘤標志物，在CRC的診療中有一定的應用價值。許多研究[22-25]表明PDPN的表達與腫瘤的惡性程度、侵襲性及轉移性有關，從而導致腫瘤進展與預后不良。本研究探索了CRC患者血漿sPDPN表達水平和臨床病理特征之間的關系，結果顯示臨床分期Ⅲ+Ⅳ期CRC患者的sPDPN表達水平高于Ⅰ+Ⅱ期者（P=0.026），N1～2期患者的sPDPN表達水平高于N0期者（P=0.049），但sPDPN的表達水平與性別、年齡、分化程度、T分期和M分期的關系無統計學意義（P>0.05），提示PDPN作為淋巴管內皮細胞的特異性標志物，sPDPN的含量與淋巴結轉移有關，sPDPN含量越高顯示患者淋巴結轉移風險越高，sPDPN可能是評估CRC患者臨床分期和轉移情況的指標。
sPDPN可作為CRC潛在的腫瘤標志物，為了評估sPDPN對CRC的預測價值，本研究將sPDPN的診斷效能與胃腸道其他腫瘤標志物如CA199、CEA進行比較，結果顯示：與CA199和CEA相比，sPDPN對CRC患者的診斷價值最高（AUC=0.882），當截斷值值為2.555 ng/mL時，靈敏度為72.9%，特異度為98.2%，這表明與其他腫瘤標志物相比sPDPN對CRC有著較高的診斷價值，可以作為一項腫瘤標志物來輔助臨床診斷，且與檢測組織PDPN蛋白、mRNA表達相比，更容易操作，患者的依從性更高。
綜上所述，CRC患者血漿中sPDPN的表達水平高于健康自愿者，且sPDPN的表達與患者的臨床分期和淋巴結轉移有關，對CRC的診斷、臨床分期和淋巴結轉移評估有一定的臨床應用價值。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：趙塞，設計試驗，實施研究、采集數據和分析解釋數據，起草文章；董圓、石林、張晨、邵子琪，實施研究和采集數據；趙益明，設計試驗，對文章的知識性內容作批評性審閱，具有支持性貢獻；王建，指導研究、設計試驗，實施研究、統計分析和解釋數據，對文章的知識性內容作批評性審閱。。
倫理聲明：本研究已通過徐州醫科大學第二附屬醫院的倫理審核批準，批文編號為：［2020］080401。
