引用本文： 杜靜芳, 葉濤, 郝瑞英, 卓見, 李沙, 劉偉光, 張瑞英. CYB561在肝細胞癌中的表達及其臨床意義. 中國普外基礎與臨床雜志, 2024, 31(8): 910-915. doi: 10.7507/1007-9424.202402028 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國普外基礎與臨床雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
肝細胞癌 （hepatocellular carcinoma，HCC） 是肝癌中最普遍的亞型，約占原發性肝癌的90%以上[1]，死亡率和發病率在所有癌癥中分別排名第4和第6[2]，與乙肝病毒（乙型肝炎）或丙肝病毒（丙型肝炎）感染、酗酒、非酒精性脂肪性肝炎等有關[3]。HCC高增殖性和高侵襲性生物學特性決定了其發病隱匿、發展迅速和預后差[4]。雖然目前的治療方法已取得較大進展，但由于化療的耐藥性和個體差異性，HCC的5年存活率為15%～38%，預后仍較差[5]。因此，尋找新的生物學標志物是當前研究重點。細胞色素b561（cytochromes b561，CYB561）屬于細胞色素b561家族成員A1[6]，位于17q23.3，是一種完整的跨膜蛋白，由位于膜兩側的血紅素-b氧化還原中心組成[7]。CYB561在人體組織中廣泛表達，參與細胞代謝、線粒體激活，可調節腎上腺素途徑，并參與鐵的攝取、抗壞血酸再生、腫瘤生長等過程[8-9]。然而，關于CYB561在HCC中的表達及其臨床意義目前鮮有報道。因此，本研究旨在利用生物信息學技術并結合免疫組織化學法（immunohistochemistry，IHC）及臨床隊列分析CYB561在HCC中的表達及其臨床意義。
1 資料與方法
1.1 臨床病例資料
1.1.1 臨床病例的獲取
選取2013年1月至2015年1月期間在河北工程大學附屬醫院行手術治療且術后完成5年隨訪的61例HCC患者作為研究對象，其中男48例，女13例；年齡32～79歲、中位年齡62歲。納入標準：① 經病理學檢查診斷為HCC；② 可獲取肝腫瘤和癌旁組織病理樣本；③ 具備完整的臨床病理特征信息。排除標準：① 組織活檢前接受過輔助治療包括化療、放療、靶向治療、免疫治療等；② 合并其他惡性腫瘤；③ 合并自身免疫性疾病；④ 既往精神病史或存在語言、認知功能障礙者。本研究獲得河北工程大學附屬醫院醫學倫理委員會的批準，批文編號：2023 ［K］ 109，且患者及其家屬簽署了知情同意書。
1.1.2 組織樣本中CYB561蛋白表達的檢測
采用IHC法檢測。取石蠟包埋的手術切除標本（包括HCC組織及其癌旁組織）進行4 μm厚的連續切片，經脫蠟和脫水處理后使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌切片，然后使用3% H2O2溶液在室溫下抑制內源性過氧化物酶活性15 min；在95 ℃的檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中進行15 min的抗原修復；切片與1%胎牛血清在37 ℃下孵育20 min，以阻斷非特異性位點。再使用PBS緩沖液多次洗滌切片后，加入1∶100稀釋的CYB561（賽默飛，PA5-
1.2 數據庫資料分析
使用TIMER數據庫（
1.3 統計學方法
采用SPSS 26.0統計軟件進行數據分析。CYB561 mRNA和蛋白在HCC組織及其癌旁組織中的表達差異分析采用獨立樣本t檢驗或配對t檢驗或配對χ2檢驗，CYB561蛋白的表達與HCC臨床病理特征間的相關性采用成組χ2檢驗，等級資料采用成組設計的Wilcoxon秩和檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，不同組間生存曲線的分析采用log-rank檢驗；采用Cox比例風險回歸模型分析各變量與HCC患者預后的關系。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 CYB561 mRNA在HCC中表達異常升高
TIMER數據庫資料分析結果顯示：CYB561 mRNA在多種腫瘤中表達上調，其中在HCC組織中CYB561 mRNA的相對表達量高于癌旁組織（P<0.001）。UALCAN數據庫納入了371例HCC組織和50例癌旁組織，分析結果顯示：在HCC組織中CYB561 mRNA的相對表達量高于癌旁組織（P<0.05）。另外，基于TNMplot數據庫的基因芯片數據集（包含了配對和非配對的HCC樣本數據），分析結果顯示：在HCC組織中CYB561 mRNA的相對表達量高于癌旁組織（P<0.05）。具體見補充材料的圖1。
圖1
示HCC 組織中CYB561 mRNA表達與HCC患者生存之間的關系
a： 通過TIMER數據庫構建的CYB561 mRNA表達與腫瘤預后的Cox比例風險回歸模型；b～e：分別是HCC組織中CYB561 mRNA表達與HCC患者的 OS （b）、RFS（c）、 PFS（d）和 DSS（e）曲線
2.2 CYB561 mRNA在HCC中的表達與不良預后相關
根據TIMER數據庫資料構建CYB561 mRNA表達與HCC預后的Cox比例風險回歸模型，其結果顯示：CYB561 mRNA表達與HCC的預后相關（P<0.05，圖1a ）。通過Kaplan-Meier Plotter數據庫資料繪制不同CYB561 mRNA表達HCC患者的生存曲線，并采用log-rank檢驗進行分析，結果顯示：與CYB561 mRNA表達陰性HCC患者相比，CYB561 mRNA表達陽性的HCC患者擁有更差的總生存期（overall survival， OS）、無復發生存期（recurrence-free survival， RFS）、無進展生存期（progression-free survival， PFS）和無病生存期（disease-free survival， DSS），均P<0.05（圖1b～1e）。
2.3 CYB561蛋白表達與HCC患者預后關系分析結果
本研究檢測了61對HCC組織及其癌旁組織中的CYB561蛋白表達情況（圖2a和2b）， 其結果顯示：CYB561蛋白主要定位于細胞質中，在HCC組織和癌旁組織中的表達陽性率分別為57.38%（35/61）和21.31%（13/61），前者高于后者，差異有統計學意義（χ2=16.624，P＜0.001）。為了探討CYB561蛋白表達與HCC患者預后的關系，根據IHC評分結果，61例患者中CYB561蛋白表達陽性35例，表達陰性26例；采用Kaplan-Meier 法繪制2組患者的生存曲線，結果顯示：CYB561蛋白表達陽性患者的OS差于表達陰性患者（P＜0.05，圖2c）。進一步分析CYB561蛋白表達與 HCC患者臨床病理特征的關系以及影響OS的因素，其結果顯示：CYB561蛋白的表達與腫瘤組織學分級有關（P=0.001），但與其他臨床病理特征無關（P＞0.05），具體見表1。采用Cox比例風險回歸模型分析HCC患者術后OS的影響因素，單因素分析結果顯示：原發病灶數（P=0.001）、組織學分級（P=0.001）、病理分期（P=0.001）和CYB651蛋白表達（P=0.036）是HCC患者術后OS的影響因素（表2）；多因素分析結果顯示：組織學分級Ⅲ ～Ⅳ級（P=0.001）和CYB561蛋白陽性表達（P=0.009）是HCC患者術后OS的危險因素（表3）。
圖2
示HCC組織和癌旁組織中CYB561蛋白的表達及CYB561蛋白表達陽性和陰性患者的OS曲線
a：CYB561蛋白在HCC組織中有代表性的陽性及陰性表達（IHC）；b： CYB561蛋白在癌旁組織中有代表性的陽性及陰性表達（IHC）；c： CYB561蛋白表達陽性和陰性患者的OS曲線
表1
HCC中CYB561蛋白的表達與HCC患者臨床病理特征間的關系（例）
表2
61 例HCC患者OS影響因素的單因素 Cox 比例風險回歸分析結果
表3
61 例HCC患者OS影響因素的多因素 Cox比例風險回歸分析結果
3 討論
HCC是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，發病率高，治愈率低，給HCC患者家庭帶來嚴重經濟負擔。在過去的20年中，HCC患者的預后幾乎沒有改善，盡管目前出現了新的治療策略，但HCC的總體預后仍然令人擔憂。因此，迫切需要尋找新的分子機制和診斷標志物，以開發有效治療HCC的策略。
CYB561是一個單拷貝的蛋白編碼基因，在整個系統發育中高度保守[10]，其在多種癌癥和組織中高表達，如神經內分泌組織，并促進抗去勢神經內分泌卵巢癌的生長和轉移[11]。此外，CYB561在乳腺癌中的表達增高提示患者的預后不良，并且與乳腺癌的免疫細胞浸潤有關 [12-13]。有研究 [14]報道稱Burkitt淋巴瘤中 CYB561A3敲除可導致溶酶體和線粒體呼吸功能損傷，誘導嚴重的鐵死亡，得出CYB561A3是Burkitt細胞生長和存活所必需的關鍵溶酶體鐵還原酶。CYB561可以作為抗壞血酸跨膜運輸的電子供體，也可以還原鐵離子[7]。抗壞血酸和鐵是細胞的重要組成成分，在許多代謝反應中是必需的輔助因子。研究[15]表明，抗壞血酸與侖伐替尼和瑞戈非尼的協同效應可作為HCC靶向治療的輔助劑。同時，抗壞血酸促進鐵的吸收并調節其代謝[16]。鐵在癌癥發生、發展和轉移中扮演著不同的角色，鐵元素是HCC發生的潛在危險因素，并且參與鐵代謝調節的一些分子通常在腫瘤細胞中表達上調，腫瘤細胞的生長依賴于微量鐵元素，以便促進腫瘤細胞的生存、增殖和轉移[17]。CYB561具有跨膜電子轉移載體和鐵還原酶的功能，可能參與了鐵代謝途徑，使其成為潛在的治療靶點。
本研究對多種數據庫中有關HCC患者資料進行分析，發現CYB561在HCC組織中的表達高于癌旁組織，提示其可能在HCC的發生和發展中發揮重要作用。本研究通過IHC技術驗證CYB561蛋白表達于細胞質中，并且在HCC組織中的表達陽性率明顯高于癌旁組織，提示CYB561可能對HCC的發生發展起到促進作用。進一步分析HCC組織中CYB561蛋白的表達與HCC臨床病理特征的關系，結果顯示CYB561蛋白的陽性表達與腫瘤的組織學分級有相關性，提示CYB561 可能與HCC惡性進展有關。Cox比例風險回歸模型分析結果顯示CYB561陽性表達是影響HCC患者生存預后的危險因素。相關研究顯示，CYB561在乳腺癌[12]、卵巢癌[11]、非小細胞肺癌[18]等腫瘤中高表達，且與腫瘤進展與不良預后密切相關。本研究結果進一步證實 HCC中CYB561的表達也可作為衡量HCC惡性程度的重要指標之一。這提示CYB561的表達水平與HCC疾病的發生、病情發展及預后有關， CYB561可能是HCC治療潛在的靶點和生物學標志物，為 HCC的診斷、預后判斷和治療提供新思路。
本研究存在一定的局限性：僅使用生物信息學分析了CYB561在人類基因轉錄組水平方面的特征，并且納入的臨床樣本數量相對較少，結果及結論可能會存在偏倚，未來需要繼續擴大研究樣本量，以獲得更準確的研究結果；并且本研究缺少細胞、動物等基礎實驗進行驗證；CYB561在HCC中參與調控的信號通路也有待進一步證明。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：杜靜芳進行臨床資料收集、數據分析并撰寫論文；葉濤、郝瑞英和卓見協助數據收集及分析；李沙指導論文修改；劉偉光負責研究方案設計、研究過程管理和論文的修改；張瑞英提供研究思路和論文修改。
倫理聲明：本研究通過了河北工程大學附屬醫院醫學倫理委員會的審批，批文編號：2023［K］109。
肝細胞癌 （hepatocellular carcinoma，HCC） 是肝癌中最普遍的亞型，約占原發性肝癌的90%以上[1]，死亡率和發病率在所有癌癥中分別排名第4和第6[2]，與乙肝病毒（乙型肝炎）或丙肝病毒（丙型肝炎）感染、酗酒、非酒精性脂肪性肝炎等有關[3]。HCC高增殖性和高侵襲性生物學特性決定了其發病隱匿、發展迅速和預后差[4]。雖然目前的治療方法已取得較大進展，但由于化療的耐藥性和個體差異性，HCC的5年存活率為15%～38%，預后仍較差[5]。因此，尋找新的生物學標志物是當前研究重點。細胞色素b561（cytochromes b561，CYB561）屬于細胞色素b561家族成員A1[6]，位于17q23.3，是一種完整的跨膜蛋白，由位于膜兩側的血紅素-b氧化還原中心組成[7]。CYB561在人體組織中廣泛表達，參與細胞代謝、線粒體激活，可調節腎上腺素途徑，并參與鐵的攝取、抗壞血酸再生、腫瘤生長等過程[8-9]。然而，關于CYB561在HCC中的表達及其臨床意義目前鮮有報道。因此，本研究旨在利用生物信息學技術并結合免疫組織化學法（immunohistochemistry，IHC）及臨床隊列分析CYB561在HCC中的表達及其臨床意義。
1 資料與方法
1.1 臨床病例資料
1.1.1 臨床病例的獲取
選取2013年1月至2015年1月期間在河北工程大學附屬醫院行手術治療且術后完成5年隨訪的61例HCC患者作為研究對象，其中男48例，女13例；年齡32～79歲、中位年齡62歲。納入標準：① 經病理學檢查診斷為HCC；② 可獲取肝腫瘤和癌旁組織病理樣本；③ 具備完整的臨床病理特征信息。排除標準：① 組織活檢前接受過輔助治療包括化療、放療、靶向治療、免疫治療等；② 合并其他惡性腫瘤；③ 合并自身免疫性疾病；④ 既往精神病史或存在語言、認知功能障礙者。本研究獲得河北工程大學附屬醫院醫學倫理委員會的批準，批文編號：2023 ［K］ 109，且患者及其家屬簽署了知情同意書。
1.1.2 組織樣本中CYB561蛋白表達的檢測
采用IHC法檢測。取石蠟包埋的手術切除標本（包括HCC組織及其癌旁組織）進行4 μm厚的連續切片，經脫蠟和脫水處理后使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌切片，然后使用3% H2O2溶液在室溫下抑制內源性過氧化物酶活性15 min；在95 ℃的檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）中進行15 min的抗原修復；切片與1%胎牛血清在37 ℃下孵育20 min，以阻斷非特異性位點。再使用PBS緩沖液多次洗滌切片后，加入1∶100稀釋的CYB561（賽默飛，PA5-
1.2 數據庫資料分析
使用TIMER數據庫（
1.3 統計學方法
采用SPSS 26.0統計軟件進行數據分析。CYB561 mRNA和蛋白在HCC組織及其癌旁組織中的表達差異分析采用獨立樣本t檢驗或配對t檢驗或配對χ2檢驗，CYB561蛋白的表達與HCC臨床病理特征間的相關性采用成組χ2檢驗，等級資料采用成組設計的Wilcoxon秩和檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，不同組間生存曲線的分析采用log-rank檢驗；采用Cox比例風險回歸模型分析各變量與HCC患者預后的關系。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 CYB561 mRNA在HCC中表達異常升高
TIMER數據庫資料分析結果顯示：CYB561 mRNA在多種腫瘤中表達上調，其中在HCC組織中CYB561 mRNA的相對表達量高于癌旁組織（P<0.001）。UALCAN數據庫納入了371例HCC組織和50例癌旁組織，分析結果顯示：在HCC組織中CYB561 mRNA的相對表達量高于癌旁組織（P<0.05）。另外，基于TNMplot數據庫的基因芯片數據集（包含了配對和非配對的HCC樣本數據），分析結果顯示：在HCC組織中CYB561 mRNA的相對表達量高于癌旁組織（P<0.05）。具體見補充材料的圖1。
圖1
示HCC 組織中CYB561 mRNA表達與HCC患者生存之間的關系
a： 通過TIMER數據庫構建的CYB561 mRNA表達與腫瘤預后的Cox比例風險回歸模型；b～e：分別是HCC組織中CYB561 mRNA表達與HCC患者的 OS （b）、RFS（c）、 PFS（d）和 DSS（e）曲線
2.2 CYB561 mRNA在HCC中的表達與不良預后相關
根據TIMER數據庫資料構建CYB561 mRNA表達與HCC預后的Cox比例風險回歸模型，其結果顯示：CYB561 mRNA表達與HCC的預后相關（P<0.05，圖1a ）。通過Kaplan-Meier Plotter數據庫資料繪制不同CYB561 mRNA表達HCC患者的生存曲線，并采用log-rank檢驗進行分析，結果顯示：與CYB561 mRNA表達陰性HCC患者相比，CYB561 mRNA表達陽性的HCC患者擁有更差的總生存期（overall survival， OS）、無復發生存期（recurrence-free survival， RFS）、無進展生存期（progression-free survival， PFS）和無病生存期（disease-free survival， DSS），均P<0.05（圖1b～1e）。
2.3 CYB561蛋白表達與HCC患者預后關系分析結果
本研究檢測了61對HCC組織及其癌旁組織中的CYB561蛋白表達情況（圖2a和2b）， 其結果顯示：CYB561蛋白主要定位于細胞質中，在HCC組織和癌旁組織中的表達陽性率分別為57.38%（35/61）和21.31%（13/61），前者高于后者，差異有統計學意義（χ2=16.624，P＜0.001）。為了探討CYB561蛋白表達與HCC患者預后的關系，根據IHC評分結果，61例患者中CYB561蛋白表達陽性35例，表達陰性26例；采用Kaplan-Meier 法繪制2組患者的生存曲線，結果顯示：CYB561蛋白表達陽性患者的OS差于表達陰性患者（P＜0.05，圖2c）。進一步分析CYB561蛋白表達與 HCC患者臨床病理特征的關系以及影響OS的因素，其結果顯示：CYB561蛋白的表達與腫瘤組織學分級有關（P=0.001），但與其他臨床病理特征無關（P＞0.05），具體見表1。采用Cox比例風險回歸模型分析HCC患者術后OS的影響因素，單因素分析結果顯示：原發病灶數（P=0.001）、組織學分級（P=0.001）、病理分期（P=0.001）和CYB651蛋白表達（P=0.036）是HCC患者術后OS的影響因素（表2）；多因素分析結果顯示：組織學分級Ⅲ ～Ⅳ級（P=0.001）和CYB561蛋白陽性表達（P=0.009）是HCC患者術后OS的危險因素（表3）。
圖2
示HCC組織和癌旁組織中CYB561蛋白的表達及CYB561蛋白表達陽性和陰性患者的OS曲線
a：CYB561蛋白在HCC組織中有代表性的陽性及陰性表達（IHC）；b： CYB561蛋白在癌旁組織中有代表性的陽性及陰性表達（IHC）；c： CYB561蛋白表達陽性和陰性患者的OS曲線
表1
HCC中CYB561蛋白的表達與HCC患者臨床病理特征間的關系（例）
表2
61 例HCC患者OS影響因素的單因素 Cox 比例風險回歸分析結果
表3
61 例HCC患者OS影響因素的多因素 Cox比例風險回歸分析結果
3 討論
HCC是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，發病率高，治愈率低，給HCC患者家庭帶來嚴重經濟負擔。在過去的20年中，HCC患者的預后幾乎沒有改善，盡管目前出現了新的治療策略，但HCC的總體預后仍然令人擔憂。因此，迫切需要尋找新的分子機制和診斷標志物，以開發有效治療HCC的策略。
CYB561是一個單拷貝的蛋白編碼基因，在整個系統發育中高度保守[10]，其在多種癌癥和組織中高表達，如神經內分泌組織，并促進抗去勢神經內分泌卵巢癌的生長和轉移[11]。此外，CYB561在乳腺癌中的表達增高提示患者的預后不良，并且與乳腺癌的免疫細胞浸潤有關 [12-13]。有研究 [14]報道稱Burkitt淋巴瘤中 CYB561A3敲除可導致溶酶體和線粒體呼吸功能損傷，誘導嚴重的鐵死亡，得出CYB561A3是Burkitt細胞生長和存活所必需的關鍵溶酶體鐵還原酶。CYB561可以作為抗壞血酸跨膜運輸的電子供體，也可以還原鐵離子[7]。抗壞血酸和鐵是細胞的重要組成成分，在許多代謝反應中是必需的輔助因子。研究[15]表明，抗壞血酸與侖伐替尼和瑞戈非尼的協同效應可作為HCC靶向治療的輔助劑。同時，抗壞血酸促進鐵的吸收并調節其代謝[16]。鐵在癌癥發生、發展和轉移中扮演著不同的角色，鐵元素是HCC發生的潛在危險因素，并且參與鐵代謝調節的一些分子通常在腫瘤細胞中表達上調，腫瘤細胞的生長依賴于微量鐵元素，以便促進腫瘤細胞的生存、增殖和轉移[17]。CYB561具有跨膜電子轉移載體和鐵還原酶的功能，可能參與了鐵代謝途徑，使其成為潛在的治療靶點。
本研究對多種數據庫中有關HCC患者資料進行分析，發現CYB561在HCC組織中的表達高于癌旁組織，提示其可能在HCC的發生和發展中發揮重要作用。本研究通過IHC技術驗證CYB561蛋白表達于細胞質中，并且在HCC組織中的表達陽性率明顯高于癌旁組織，提示CYB561可能對HCC的發生發展起到促進作用。進一步分析HCC組織中CYB561蛋白的表達與HCC臨床病理特征的關系，結果顯示CYB561蛋白的陽性表達與腫瘤的組織學分級有相關性，提示CYB561 可能與HCC惡性進展有關。Cox比例風險回歸模型分析結果顯示CYB561陽性表達是影響HCC患者生存預后的危險因素。相關研究顯示，CYB561在乳腺癌[12]、卵巢癌[11]、非小細胞肺癌[18]等腫瘤中高表達，且與腫瘤進展與不良預后密切相關。本研究結果進一步證實 HCC中CYB561的表達也可作為衡量HCC惡性程度的重要指標之一。這提示CYB561的表達水平與HCC疾病的發生、病情發展及預后有關， CYB561可能是HCC治療潛在的靶點和生物學標志物，為 HCC的診斷、預后判斷和治療提供新思路。
本研究存在一定的局限性：僅使用生物信息學分析了CYB561在人類基因轉錄組水平方面的特征，并且納入的臨床樣本數量相對較少，結果及結論可能會存在偏倚，未來需要繼續擴大研究樣本量，以獲得更準確的研究結果；并且本研究缺少細胞、動物等基礎實驗進行驗證；CYB561在HCC中參與調控的信號通路也有待進一步證明。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：杜靜芳進行臨床資料收集、數據分析并撰寫論文；葉濤、郝瑞英和卓見協助數據收集及分析；李沙指導論文修改；劉偉光負責研究方案設計、研究過程管理和論文的修改；張瑞英提供研究思路和論文修改。
倫理聲明：本研究通過了河北工程大學附屬醫院醫學倫理委員會的審批，批文編號：2023［K］109。
