引用本文： 陳鑫明, 趙平武, 何運勝, 黃坤, 黃朝林, 劉洋, 廖烽丸. 奶酪或茶攝入與胃食管反流病的因果關聯：兩樣本孟德爾隨機化研究. 中國普外基礎與臨床雜志, 2024, 31(9): 1099-1104. doi: 10.7507/1007-9424.202404018 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國普外基礎與臨床雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是一種因胃內容物倒流至食道引起癥狀和（或）并發癥的疾病，主要表現為胃灼熱、反酸，嚴重者還包括吞咽困難、消化道出血、慢性咳嗽等[1]。 GERD是一種常見的消化道疾病，成人患病率為13.3% ［95%CI為（12.0%，14.6%）］[2]，且有持續上升趨勢，造成了沉重的疾病和經濟負擔[3]。飲食與生活方式因素被認為可影響GERD的發生[4]。奶酪是一種常見的乳制品，含有大量脂肪[5]，茶則是常見的飲品，二者都是人們日常生活中較常見的兩種食品。目前已有大量的研究[6–14]表明奶酪等乳制品或茶攝入對GERD發生風險的影響。上述研究大多為觀察性研究及meta分析，由于觀察性研究結論易受各種混雜因素的影響[15]，而基于大量觀察性研究的meta分析也不能消除混雜偏倚，還可因為方法學上的缺陷而引起研究結論出現更大的偏差[16]。因此，奶酪或茶攝入與GERD發生風險的因果關系仍存在爭議，有必要基于可靠的因果推斷方法來明確奶酪或茶攝入對GERD發生風險的因果效應。孟德爾隨機化研究目前被認為是“天然的隨機對照試驗”[17]，其主要原理是通過遺傳變異在配子形成過程中隨機分裂、組合的特點，對目標研究人群實行模擬隨機分配[18]，從而更可靠地推斷出因果關系[19]。
本研究基于公開的全基因組關聯研究（genome-wide association studies，GWAS）數據，使用雙樣本孟德爾隨機化分析，探索奶酪或茶攝入與GERD發生風險的因果效應，以期為預防GERD的發生提供參考依據。
1 資料與方法
1.1 數據來源
本研究使用的所有數據來自于IEU OpenGWAS數據庫。 奶酪（ “ukb-b-
1.2 工具變量的篩選方法
對于奶酪或茶攝入作為暴露因素、GERD作為結局的孟德爾隨機化（Mendelian randomization，MR）正向分析，本研究進行了嚴格的SNPs篩選，工具變量篩選條件如下：① SNPs與奶酪或茶攝入之間應該高度相關（顯著性閾值設置為P<5×10?8）；② 去除連鎖不平衡導致的偏倚（R2<0.001，kb=10 000）；③ 將暴露因素的SNPs與結局變量的SNPs進行匯總，同時刪除不相容等位基因和中等等位基因頻率的回文等位基因。經上述篩選步驟后留下的SNPs最終作為奶酪或茶攝入的工具變量用于MR正向分析。同時，本研究計算了奶酪或茶攝入的工具變量的統計量F值以評估工具變量的強弱性，以 F=10為界值，若F>10則為強工具變量，反之即為弱工具變量，將F<10的弱工具變量SNPs從分析中排除。統計量F值為工具變量中單個SNP的F值總和，單個SNP的F值計算公式如下：
 |
N為工具變量的有效樣本量，K為工具變量的個數，R2的計算公式如下：
 |
MAF為SNP的次要等位基因頻率，β為SNP的等位基因效應值，SE為SNP 的標準誤（standard error，SE）。SE×
即為標準差（standard deviation，SD）。
1.3 MR分析與敏感性分析
在雙樣本單向MR分析中，逆方差加權法（inverse variance weighted，IVW）被用作主要分析方法。 IVW法是使用多個SNP獲得MR估計的最簡單方法，IVW 法的特點是擬合時使用的權重為結局方差的倒數，回歸時不考慮截距項，是兩樣本MR研究的標準估計方法[20]，IVW法包含隨機效應模型和固定效應模型。當結果存在異質性時，以IVW隨機效應模型作為金標準、IVW固定效應為補充方法；當結果無異質性時，則以IVW固定效應模型為金標準、IVW隨機效應模型為補充方法[21-22]。而 MR Egger和加權中位數法（weighted median，WM）則用于完善IVW結果，以提供更有力且更廣泛的評估。采用Cochrane’s Q檢驗對結果進行異質性檢驗，P<0.05為存在異質性，P>0.05為不存在異質性。采用MR Egger截距法分析水平多效性。采用“留一法”逐一剔除單個 SNP 進行敏感性分析以評價結果的穩健性。通過觀察漏斗圖的對稱性來檢查可能存在的水平多效性，以衡量當前MR分析的可靠性。此外，使用β值和比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區間（confidence interval，CI）呈現奶酪或茶攝入與GERD發生風險之間的因果關聯。基于R 4.3.1軟件，在 R Studio中調用“TwoSampleMR”（版本：0.5.9）包進行統計分析，并對主要分析結果進行可視化。檢驗水準α=0.05。研究具體流程見圖1。
圖1
示兩樣本MR設計思路
2 結果
2.1 奶酪攝入與GERD的因果關聯分析結果
奶酪攝入與GERD因果關聯分析中共納入19個有效的SNPs（表1），其 F值范圍為29.537 006 05～57.484 581 11，均為強工具變量。除 MR Egger結果無統計學意義以外，在WM、IVW隨機效應模型和 IVW固定效應模型中均觀察到，奶酪攝入與GERD間存在因果關聯（表2和圖2a）。因Cochran’s Q 檢驗提示結果存在異質性（P<0.001），故以 IVW隨機效應模型的結果作為主要結論，即奶酪攝入對減少GERD發生風險之間可能存在正向因果關系。
表1
奶酪攝入的工具變量特征
表2
孟德爾隨機化分析結果
圖2
示奶酪和茶攝入與GERD發生的因果關聯分析結果
a～d：奶酪攝入與GERD發生的因果關聯分析的森林圖（a）、散點圖（b）、留一法結果（c）及漏斗圖（d）；e～h：茶攝入與GERD發生的因果關聯分析的森林圖（e）、散點圖（f）、留一法結果（g）及漏斗圖（h）
MR Egger回歸分析結果表明，與奶酪強相關的SNP不存在水平多效性（截距為0.003，P=0.848），見圖2b。留一法（圖2c）和漏斗圖（圖2d）的結果表明，納入的19個SNPs的因果效應估計值分布基本對稱，整體不存在異質性。表明分析沒有違反與IVW隨機效應模型相似的因果估計。
2.2 茶攝入與GERD的因果關聯分析分析結果
茶攝入與GERD因果關聯分析中共納入15個有效的SNPs（表3），其 F值范圍為30.021 171 24～493.645 564 10，均為強工具變量。除MR Egger結果無統計學意義以外，在WM、IVW隨機效應模型和 IVW固定效應模型中均觀察到，茶攝入與GERD間存在因果關聯（表2和圖2e）。因Cochran’s Q檢驗提示結果存在異質性（P<0.001），故結果以 IVW隨機效應模型的結果作為主要結論，即茶攝入對增加GERD發生風險之間可能存在正向因果關系。
表3
茶攝入的工具變量特征
MR Egger回歸分析結果表明與茶葉強相關的SNP不存在水平多效性（截距為0.005，P=0.659），見圖2f。留一法（圖2g）和漏斗圖（圖2h）的結果表明，納入的15個SNPs的因果效應估計值分布基本對稱，整體不存在異質性。表明分析沒有違反與IVW隨機效應模型相似的因果估計。
3 討論
本研究采用兩樣本MR分析方法，利用GWAS數據，分析了奶酪或茶攝入與GERD之間的因果關聯。結果顯示，奶酪攝入對減少GERD發生風險之間可能存在正向因果關系；茶攝入對增加GERD發生風險之間可能存在正向因果關系。
GERD是一種因胃內容物倒流至食道引起癥狀和（或）并發癥的疾病，GERD可引起患者生活質量下降，長期治療的需要可消耗大量衛生資源，給社會帶來高昂的成本。同時老年GERD患者由于目前診斷及治療方法的限制，具有不易痊愈的特點[23]。因此，預防GERD的發生顯得至關重要。目前較多研究[6–14]表明，飲食或生活習慣與GERD發病風險有關系。 關于乳制品，Fernando等[24]的研究表明，乳制品攝入量與GERD發生率無關，但是該研究主要研究人群為代謝綜合征患者，具有一定局限性，故并不能代表在正常人群中乳制品攝入量與GERD發生率的關系。更多的研究[6–9]表明，乳制品與GERD發生風險的關系目前還有爭議。Ndebia等[6]、Chen等[7]的研究表明，乳制品是反酸的危險因素。另一些研究結果[8-9]卻表明，乳制品對GERD發生具有保護作用。奶酪是一種常見的乳制品，本研究結果表明，奶酪攝入對減少GERD發生風險之間可能存在正向因果關系，這可能與腸道菌群失調有關[25-26]。關于茶攝入，一項印度人群的meta分析結果[10]表明，茶攝入量是GERD的危險因素。一項針對大學生的研究[11]表明，與從不喝茶的學生相比，每天喝綠茶學生更容易患GERD。Gu等[12]的研究表明，茶攝入與胃酸暴露時間及反流發作次數有關。本研究結果表明，茶攝入對增加GERD發生風險之間可能存在正向因果關系，這可能跟茶堿引起食管括約肌松弛[27]有關。
本研究也存在一定的局限性。① 所有GWAS數據均來自歐洲人群，因此限制了研究結果在其他人群中的推廣性；② MR分析結果不能直接與來自臨床研究的OR值進行比較，只能通過OR值判斷效應方向；③ 本研究并未對奶酪具體攝入量、茶的種類等做進一步探討，可能會致使實驗結果不準確；④ 研究結論僅基于統計學結果，無法進一步探討奶酪或茶攝入與GERD之間的生物學機制。
本研究通過兩樣本MR分析方法，從基因層面表明奶酪或茶攝入與GERD的發生風險存在因果關系，但仍需在更大的 GWAS數據中進行驗證。在未來應關注奶酪或茶攝入與GERD發生風險相關作用靶點及機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明： 陳鑫明與趙平武共同設計研究、撰寫論文初稿及最后全文校正；何運勝負責圖表校正及最后全文校正；黃坤完成數據提取、整理及分析，校正圖表；黃朝林參與撰寫論文初稿；劉洋完成表格和圖片制作；廖烽丸完成數據提取、整理。
胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是一種因胃內容物倒流至食道引起癥狀和（或）并發癥的疾病，主要表現為胃灼熱、反酸，嚴重者還包括吞咽困難、消化道出血、慢性咳嗽等[1]。 GERD是一種常見的消化道疾病，成人患病率為13.3% ［95%CI為（12.0%，14.6%）］[2]，且有持續上升趨勢，造成了沉重的疾病和經濟負擔[3]。飲食與生活方式因素被認為可影響GERD的發生[4]。奶酪是一種常見的乳制品，含有大量脂肪[5]，茶則是常見的飲品，二者都是人們日常生活中較常見的兩種食品。目前已有大量的研究[6–14]表明奶酪等乳制品或茶攝入對GERD發生風險的影響。上述研究大多為觀察性研究及meta分析，由于觀察性研究結論易受各種混雜因素的影響[15]，而基于大量觀察性研究的meta分析也不能消除混雜偏倚，還可因為方法學上的缺陷而引起研究結論出現更大的偏差[16]。因此，奶酪或茶攝入與GERD發生風險的因果關系仍存在爭議，有必要基于可靠的因果推斷方法來明確奶酪或茶攝入對GERD發生風險的因果效應。孟德爾隨機化研究目前被認為是“天然的隨機對照試驗”[17]，其主要原理是通過遺傳變異在配子形成過程中隨機分裂、組合的特點，對目標研究人群實行模擬隨機分配[18]，從而更可靠地推斷出因果關系[19]。
本研究基于公開的全基因組關聯研究（genome-wide association studies，GWAS）數據，使用雙樣本孟德爾隨機化分析，探索奶酪或茶攝入與GERD發生風險的因果效應，以期為預防GERD的發生提供參考依據。
1 資料與方法
1.1 數據來源
本研究使用的所有數據來自于IEU OpenGWAS數據庫。 奶酪（ “ukb-b-
1.2 工具變量的篩選方法
對于奶酪或茶攝入作為暴露因素、GERD作為結局的孟德爾隨機化（Mendelian randomization，MR）正向分析，本研究進行了嚴格的SNPs篩選，工具變量篩選條件如下：① SNPs與奶酪或茶攝入之間應該高度相關（顯著性閾值設置為P<5×10?8）；② 去除連鎖不平衡導致的偏倚（R2<0.001，kb=10 000）；③ 將暴露因素的SNPs與結局變量的SNPs進行匯總，同時刪除不相容等位基因和中等等位基因頻率的回文等位基因。經上述篩選步驟后留下的SNPs最終作為奶酪或茶攝入的工具變量用于MR正向分析。同時，本研究計算了奶酪或茶攝入的工具變量的統計量F值以評估工具變量的強弱性，以 F=10為界值，若F>10則為強工具變量，反之即為弱工具變量，將F<10的弱工具變量SNPs從分析中排除。統計量F值為工具變量中單個SNP的F值總和，單個SNP的F值計算公式如下：
|
N為工具變量的有效樣本量，K為工具變量的個數，R2的計算公式如下：
|
MAF為SNP的次要等位基因頻率，β為SNP的等位基因效應值，SE為SNP 的標準誤（standard error，SE）。SE×即為標準差（standard deviation，SD）。
1.3 MR分析與敏感性分析
在雙樣本單向MR分析中，逆方差加權法（inverse variance weighted，IVW）被用作主要分析方法。 IVW法是使用多個SNP獲得MR估計的最簡單方法，IVW 法的特點是擬合時使用的權重為結局方差的倒數，回歸時不考慮截距項，是兩樣本MR研究的標準估計方法[20]，IVW法包含隨機效應模型和固定效應模型。當結果存在異質性時，以IVW隨機效應模型作為金標準、IVW固定效應為補充方法；當結果無異質性時，則以IVW固定效應模型為金標準、IVW隨機效應模型為補充方法[21-22]。而 MR Egger和加權中位數法（weighted median，WM）則用于完善IVW結果，以提供更有力且更廣泛的評估。采用Cochrane’s Q檢驗對結果進行異質性檢驗，P<0.05為存在異質性，P>0.05為不存在異質性。采用MR Egger截距法分析水平多效性。采用“留一法”逐一剔除單個 SNP 進行敏感性分析以評價結果的穩健性。通過觀察漏斗圖的對稱性來檢查可能存在的水平多效性，以衡量當前MR分析的可靠性。此外，使用β值和比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區間（confidence interval，CI）呈現奶酪或茶攝入與GERD發生風險之間的因果關聯。基于R 4.3.1軟件，在 R Studio中調用“TwoSampleMR”（版本：0.5.9）包進行統計分析，并對主要分析結果進行可視化。檢驗水準α=0.05。研究具體流程見圖1。
圖1
示兩樣本MR設計思路
2 結果
2.1 奶酪攝入與GERD的因果關聯分析結果
奶酪攝入與GERD因果關聯分析中共納入19個有效的SNPs（表1），其 F值范圍為29.537 006 05～57.484 581 11，均為強工具變量。除 MR Egger結果無統計學意義以外，在WM、IVW隨機效應模型和 IVW固定效應模型中均觀察到，奶酪攝入與GERD間存在因果關聯（表2和圖2a）。因Cochran’s Q 檢驗提示結果存在異質性（P<0.001），故以 IVW隨機效應模型的結果作為主要結論，即奶酪攝入對減少GERD發生風險之間可能存在正向因果關系。
表1
奶酪攝入的工具變量特征
表2
孟德爾隨機化分析結果
圖2
示奶酪和茶攝入與GERD發生的因果關聯分析結果
a～d：奶酪攝入與GERD發生的因果關聯分析的森林圖（a）、散點圖（b）、留一法結果（c）及漏斗圖（d）；e～h：茶攝入與GERD發生的因果關聯分析的森林圖（e）、散點圖（f）、留一法結果（g）及漏斗圖（h）
MR Egger回歸分析結果表明，與奶酪強相關的SNP不存在水平多效性（截距為0.003，P=0.848），見圖2b。留一法（圖2c）和漏斗圖（圖2d）的結果表明，納入的19個SNPs的因果效應估計值分布基本對稱，整體不存在異質性。表明分析沒有違反與IVW隨機效應模型相似的因果估計。
2.2 茶攝入與GERD的因果關聯分析分析結果
茶攝入與GERD因果關聯分析中共納入15個有效的SNPs（表3），其 F值范圍為30.021 171 24～493.645 564 10，均為強工具變量。除MR Egger結果無統計學意義以外，在WM、IVW隨機效應模型和 IVW固定效應模型中均觀察到，茶攝入與GERD間存在因果關聯（表2和圖2e）。因Cochran’s Q檢驗提示結果存在異質性（P<0.001），故結果以 IVW隨機效應模型的結果作為主要結論，即茶攝入對增加GERD發生風險之間可能存在正向因果關系。
表3
茶攝入的工具變量特征
MR Egger回歸分析結果表明與茶葉強相關的SNP不存在水平多效性（截距為0.005，P=0.659），見圖2f。留一法（圖2g）和漏斗圖（圖2h）的結果表明，納入的15個SNPs的因果效應估計值分布基本對稱，整體不存在異質性。表明分析沒有違反與IVW隨機效應模型相似的因果估計。
3 討論
本研究采用兩樣本MR分析方法，利用GWAS數據，分析了奶酪或茶攝入與GERD之間的因果關聯。結果顯示，奶酪攝入對減少GERD發生風險之間可能存在正向因果關系；茶攝入對增加GERD發生風險之間可能存在正向因果關系。
GERD是一種因胃內容物倒流至食道引起癥狀和（或）并發癥的疾病，GERD可引起患者生活質量下降，長期治療的需要可消耗大量衛生資源，給社會帶來高昂的成本。同時老年GERD患者由于目前診斷及治療方法的限制，具有不易痊愈的特點[23]。因此，預防GERD的發生顯得至關重要。目前較多研究[6–14]表明，飲食或生活習慣與GERD發病風險有關系。 關于乳制品，Fernando等[24]的研究表明，乳制品攝入量與GERD發生率無關，但是該研究主要研究人群為代謝綜合征患者，具有一定局限性，故并不能代表在正常人群中乳制品攝入量與GERD發生率的關系。更多的研究[6–9]表明，乳制品與GERD發生風險的關系目前還有爭議。Ndebia等[6]、Chen等[7]的研究表明，乳制品是反酸的危險因素。另一些研究結果[8-9]卻表明，乳制品對GERD發生具有保護作用。奶酪是一種常見的乳制品，本研究結果表明，奶酪攝入對減少GERD發生風險之間可能存在正向因果關系，這可能與腸道菌群失調有關[25-26]。關于茶攝入，一項印度人群的meta分析結果[10]表明，茶攝入量是GERD的危險因素。一項針對大學生的研究[11]表明，與從不喝茶的學生相比，每天喝綠茶學生更容易患GERD。Gu等[12]的研究表明，茶攝入與胃酸暴露時間及反流發作次數有關。本研究結果表明，茶攝入對增加GERD發生風險之間可能存在正向因果關系，這可能跟茶堿引起食管括約肌松弛[27]有關。
本研究也存在一定的局限性。① 所有GWAS數據均來自歐洲人群，因此限制了研究結果在其他人群中的推廣性；② MR分析結果不能直接與來自臨床研究的OR值進行比較，只能通過OR值判斷效應方向；③ 本研究并未對奶酪具體攝入量、茶的種類等做進一步探討，可能會致使實驗結果不準確；④ 研究結論僅基于統計學結果，無法進一步探討奶酪或茶攝入與GERD之間的生物學機制。
本研究通過兩樣本MR分析方法，從基因層面表明奶酪或茶攝入與GERD的發生風險存在因果關系，但仍需在更大的 GWAS數據中進行驗證。在未來應關注奶酪或茶攝入與GERD發生風險相關作用靶點及機制。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明： 陳鑫明與趙平武共同設計研究、撰寫論文初稿及最后全文校正；何運勝負責圖表校正及最后全文校正；黃坤完成數據提取、整理及分析，校正圖表；黃朝林參與撰寫論文初稿；劉洋完成表格和圖片制作；廖烽丸完成數據提取、整理。
