引用本文： 劉雙飛, 張熙冰, 焦凌峰, 冉江華. 鈣離子/鈣調蛋白/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ信號通路在肝纖維化調控中作用的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2024, 31(9): 1141-1146. doi: 10.7507/1007-9424.202404021 復制
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肝纖維化是肝損傷后的創傷愈合發生的再生過程，在此過程中損傷因子持續存在，它可導致肝臟基質組織過量沉積和肝功能受損，至終末期時肝纖維化會發展為肝硬化。每年因肝硬化導致的肝功能失代償和肝細胞癌中約有200萬人死亡，占全球所有死亡人數的3.5%以上[1]。因此，對肝纖維化進行了解和干預意義重大。目前普遍認同肝纖維化是一個動態且可逆的過程[2]。鑒于此，避免肝纖維化進展為肝硬化，通過阻斷或逆轉肝纖維化的進程已成為治療肝臟疾病（簡稱“肝病” ）纖維化的核心內容。目前臨床上盡管已采用病因治療、肝細胞保護、抗氧化治療等對癥處理對肝纖維化進行干預，但仍未發現特異有效的抗肝纖維化的方法，因此對其機制及相關通路進行進一步深入了解仍有必要。現有相關研究發現，鈣離子（ionized free calcium，Ca2+）可通過鈣調蛋白（calmodulin，CaM）依賴的蛋白激酶Ⅱ（CaM dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）參與肝纖維化，它在肝纖維化中扮演重要角色[3]。現對Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路在肝纖維化中的作用研究的成果進行歸納總結，旨在為通過對該信號通路的干預防治臨床肝纖維化提供新思路。
1 肝纖維化及其機制
肝纖維化是脂肪性、病毒性、酒精性或非酒精性脂肪性等慢性肝病進展過程中的共同階段，是肝硬化發展的階段性病理表現，其病理特征為肝小葉中央區和匯管區有不同程度的纖維組織增生或纖維間隔形成，它主要涉及細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的產生及降解失衡[4]以及促炎和抗炎失衡。最常見的纖維化肝病是非酒精性脂肪性肝病和病毒性肝病，其中非酒精性脂肪性肝病常發展為非酒精性脂肪性肝炎[5]，在此過程中的主要病理學改變是肝小葉炎癥和肝細胞氣球樣變，脂毒性、氧化還原失衡、內質網應激、炎癥激活和細胞凋亡參與了此過程[6]；在病毒性肝病發展為病毒性肝炎過程中，非實質細胞在干擾素基因刺激因子作用下產生干擾素和促炎因子，從而啟動免疫反應抑制病毒復制，同時導致結締組織增生而造成肝細胞結構功能紊亂[7]，當受到病毒等病理因子刺激時肝臟發生免疫細胞聚集和炎癥激活，以啟動纖維化過程修復損傷，炎癥進一步激活肝星狀細胞轉化為肌成纖維細胞，從而分泌α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和肝細胞生長因子，加速肝纖維化形成[8-9]。當損傷為短期存在或自限性時，這一反應過程可被逆轉，肝臟結構可恢復正常；但是像酒精性、脂質性等慢性損傷因子持續存在或反復時，肝臟發生促炎與抗炎失衡和ECM產生及降解失衡。ECM穩態失衡會導致肝實質內纖維瘢痕增多、正常肝小葉結構被破壞，從而發生纖維化；而炎癥失衡則通過損傷肝功能而影響纖維化分期。
1.1 ECM產生及降解失衡
ECM穩態失衡是纖維化發生及發展中的重要狀態。成纖維細胞是ECM合成分泌的主要來源，其中肌成纖維細胞是一種假定的成纖維細胞亞型，它是纖維化反應的關鍵效應細胞，而大部分肌成纖維細胞由肝星狀細胞分化形成，肝星狀細胞在肝纖維化的發生及發展中起重要作用[10]。肝星狀細胞作為一種非實質細胞，在肝纖維化病理生理過程中能分泌ECM并參與膠原形成、合成基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和基質金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs），促進ECM產生和降解穩態失衡；此外，它還能調節肝竇內微循環推進纖維化進程。在靜息狀態下，肝星狀細胞位于Disse間隙，主要分泌Ⅳ型膠原纖維，當病毒、乙醇、脂質等各種病理因子持續刺激，導致巨噬細胞激活釋放細胞因子，在血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、胰島素樣生長因子-1、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等細胞因子誘導下肝星狀細胞被激活分化，同時發生遷移并移至損傷部位，增殖并轉化為成纖維細胞，合成大量ECM和Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的膠原纖維，并且上調TIMPs表達導致ECM的降解減少[1, 11]，從而造成ECM的產生及降解失衡；同時肌成纖維細胞內含有肌絲使得它兼有收縮功能，在肝損傷修復后期，這種收縮作用和ECM的過量產生共同作用破壞肝小葉結構，導致假小葉形成，從而引起肝臟發生纖維化。
1.2 促炎和抗炎失衡
炎癥是各種急慢性肝病進展的重要因素，炎癥應答最初是為了阻斷細菌、病毒等刺激，保護肝臟免受進一步損害，在這種應答過程中Kupffer細胞、肥大細胞等炎癥應答細胞激活產生了一系列細胞因子，這類細胞因子在誘導免疫細胞聚集清除損傷因素的同時也對肝星狀細胞產生造成一系列反應，從而加速或延緩肝纖維化的發生。Kupffer細胞是一種肝臟中特殊類型巨噬細胞，它在肝損傷時應答激活參與炎癥調控，其他類型巨噬細胞如M1和M2型巨噬細胞，M1型細胞在干擾素γ、脂多糖激活下分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ、白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6等促進炎癥發生損傷肝細胞；而M2型細胞在IL-4、IL-13作用下分泌IL-10發揮抗炎作用，但同時它也分泌TGF-β1、PDGF等細胞因子誘導肝星狀細胞活化促進肝纖維化進程[12]。TGF-β1和TNF-α作為多功能細胞因子，是肝纖維化刺激肝星狀細胞從靜止細胞活化為肌成纖維細胞的關鍵調節因子，它通過上調α-SMA介導肝星狀細胞轉分化為肌成纖維細胞和刺激Ⅰ型膠原和其他基質表達[13-14]，而TNF-α可通過激活核因子-κB、Bcl-XL和p21誘導活化肝星狀細胞抗凋亡，但它又能激活caspase-8產生促細胞凋亡[12]。此外，IL-17和IL-1是纖維化過程中兩個較為重要的炎癥因子，IL-17由另一種免疫應答細胞Th17細胞產生，它可誘導 Kupffer細胞和M1、M2型細胞產生IL-6、IL-1β、TNF-α、TGF-β1等細胞因子促進α-SMA和TGF-β1表達增加，從而作用于肝星狀細胞而實現炎癥反應和肝星狀細胞激活之間串聯[15-16]，IL-1則通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路中的核心成員c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38通路上調MMP-13和TIMP表達參與纖維化進程。另一類在纖維化中發揮作用的炎性細胞是肥大細胞，它可通過抑制MMP和促進其抑制劑TIMP抑制ECM降解參與纖維化調控[17]。由此可見，炎癥在肝纖維化中扮演了一個始動者作用，炎性細胞被激活后產生TNF-α、TGF-β、IL等細胞因子[18]，這些細胞因子在誘導肝星狀細胞活化的同時，還激活肝細胞保護、程序性死亡等信號傳導途徑調節肝臟損傷后自我修復，當這種修復作用超出其自身調節能力則引起炎癥失衡，進一步加重損傷并促進纖維化發展。
2 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路及它在肝纖維化過程中的作用
2.1 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路概述
Ca2+ 是細胞內不可或缺的第二信使，參與控制多種功能。內質網內Ca2+ 濃度變化參與蛋白質合成及無機物代謝，線粒體內Ca2+ 濃度調節參與三磷酸腺苷合成、三羧酸循環[19]、細胞凋亡[20]等。Ca2+ 濃度平衡是胞內“鈣庫”攝取和釋放鈣、跨細胞膜鈣離子轉運共同作用的結果。肝細胞內Ca2+ 濃度變化參與膽汁酸分泌、物質能量代謝、蛋白質合成和分泌、細胞周期調控、細胞增殖和程序性死亡、溶酶體、其他囊泡運動等幾乎所有肝細胞生理和病理過程[21-23]。
CaM是真核細胞內主要的Ca2+ 傳感器，是哺乳動物中Ca2+ 信號的主要轉導蛋白[24]，它在胞內無酶活性，通過作為Ca2+ 的轉運體和結合激活CaMKⅡ而發揮作用。細胞內Ca2+ 濃度的升高既能促進細胞增殖[25]，也能誘導細胞凋亡[26]，因此，CaM作為細胞內Ca2+ 的轉運體對細胞凋亡能發揮正向或負向的調節作用。CaM可能通過多種不同的機制調節細胞增殖，如CaM易位到細胞核并驅動血管平滑肌細胞的表型轉換[27]，CaM可通過與caspase相互作用而誘導肝星狀細胞凋亡[28]，CaM還能直接結合轉錄因子（CaM結合轉錄激活因子）參與多種組織中細胞的生長、分化調節[29]。
CaMK是Ca2+-CaM復合物調控的下游靶酶之一。CaMK是一個對多種細胞刺激產生反應的蛋白家族。多功能CaMK的成員包括CaMKⅠ、CaMKⅡ和CaMKⅣ[29-30]，其中CaMKⅡ包含 α、β、γ、δ 4種亞基和17種同工酶，它在哺乳動物全身各組織中均有廣泛表達，但在不同的組織中其表達量及亞基構成不一樣，如γ亞基在肝臟組織中的比例較高[31]。CaMKⅡ具有自激活功能，由鈣調素直接激活[32-33]。相關研究顯示，CaMKⅡ是細胞中Ca2+/CaM信號通路的下游效應蛋白，而CaMKⅡγ是細胞凋亡和自噬的上游調節因子，與Ca2+/CaM/CaMKⅡ結合可緩解CaMKⅡ家族酶的羧化結構域的自抑制作用，CaMKⅡ多聚、導致自磷酸化和相互磷酸化，從而延長激酶活性，觸發廣泛的信號傳導作用參與細胞凋亡[34-36]。大鼠肝移植缺血再灌注模型中，CaMKⅡγ與肝細胞肝酶異常、線粒體功能障礙和凋亡呈高度正相關[37]，這也證實了CaMKⅡγ可介導肝細胞發生凋亡和功能障礙。CaMKⅡ被廣泛證實參與器官纖維化。在腎臟中，CaMKⅡ可通過誘導細胞外調節激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）激活參與急性和慢性腎纖維化，抑制其表達后腎臟纖維化標志物蛋白、Ⅰ型膠原、MMP2和α-SMA的表達均被顯著抑制，腎臟纖維化明顯緩解[38]。同樣，在心臟纖維化研究中，抑制CaMKⅡ激活可延緩心肌不良重構并表現抗心律失常作用[39-40]。在肝纖維化中，CaMKⅡγ同樣被證實參與肝纖維化調控，且鑒于其上游Ca2+ 對肝臟的雙重調控作用，CaMKⅡγ對肝纖維化同樣表現為正、負向雙重調控。
2.2 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路在肝纖維化中的作用
肝纖維化是一個涉及多因素、多環節作用的、復雜的動態過程，肝星狀細胞的激活是肝纖維化發生、發展過程中的共同中心事件和關鍵步驟[41]，激活的肝星狀細胞通過增殖分泌大量ECM促進肝纖維化和通過細胞收縮而使肝竇內壓升高導致肝硬化與門靜脈高壓[42]。現階段關于肝纖維化發生機制的研究主要集中在TGF-β1信號轉導通路、PDGF信號轉導通路、Hippo信號通路、活性氧作用于肝星狀細胞的激活等方面[43]，而Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路主要通過TGF-β1和PDGF相關通路參與肝纖維化調控，對其纖維化調控主要表現在促進或抑制肝星狀細胞增殖和促進肝星狀細胞凋亡。
2.2.1 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路在TGF-β1調控肝纖維化中的作用
TGF-β1是當前最強促纖維化因子之一，TGF-β1/Smad信號轉導在纖維化中的作用已得到充分證實[44]。Smad蛋白家族是TGF-β1信號通路中下游的重要效應因子，其中Smad3和Smad4是促纖維化的，而Smad2和Smad7則負向調控肝纖維化。TGF-β1激活TGF-β受體Ⅰ型激酶，導致Smad2、Smad3磷酸化與Smad4復合物結合轉導信號至細胞核發揮生物學效應[45]。Smad3過度表達能夠抑制成纖維細胞中MMP-1活性而抑制ECM降解，Smad2和Smad7通過抑制Smad3信號對肝纖維化發揮負向作用[46-47]。此外，TGF-β1也能促進p65的磷酸化、甲硫氨酸腺苷轉移酶2A的轉錄表達和隨之而來的S-腺苷甲硫氨酸濃度降低來刺激肝星狀細胞活化。TGF-β1可通過多種細胞內信號轉導途徑如MAPK通路等參與肝星狀細胞的活化與增殖。ERK是MAPK家族一員，在TGF-β1誘導肝星狀細胞增殖實驗[48]中發現，ERK發生磷酸化呈現高表達狀態，然而在抑制CaMKⅡ表達后，這種磷酸化被減弱，提示CaMKⅡ/ERK信號通路是TGF-β1誘導肝星狀細胞增殖的重要調控信號通路。另一研究[49]結果顯示，TGF-β1可以誘導肝星狀細胞活化增殖，分別用低、中、高濃度CaMKⅡ抑制劑處理后，TGF-β1誘導的肝星狀細胞增殖呈逐步下降趨勢且肝星狀細胞凋亡率逐步增高，同時內質網應激途徑蛋白caspase-12高表達，這提示CaMKⅡ不僅可以通過促進肝星狀細胞增殖，還可以通過介導內質網應激誘導肝星狀細胞凋亡參與肝纖維化調控。與此同時，在體外肝星狀細胞誘導中，增加細胞內Ca2+ 濃度后，肝星狀細胞出現不同程度凋亡，且內質網應激途徑標志蛋白葡萄糖調節蛋白-78和caspase-12表達明顯上調[26]，這提示Ca2+ 可能通過增加內質網應激誘導肝星狀細胞凋亡。由此可見，Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路通過在TGF-β1/MAPK活化肝星狀細胞過程中發揮作用而參與肝纖維化調控。
2.2.2 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路在PDGF調控肝纖維化中的作用
PDGF被認為是最有效的促有絲分裂原之一，是肝纖維化最有效的增殖因子，它激活細胞內信號，Ca2+ 信號參與了PDGF通路，而Ca2+/CaMKⅡ對人類肝星狀細胞的增殖至關重要。外源性PDGF可以激活MAPK信號通路，該信號通路的3個核心成員ERK1/2、JNK和p38均參與了對肝星狀細胞活化、增殖、凋亡的調控而參與肝纖維化的形成[50-52]。有研究[53]顯示，在PDGF誘導肝星狀細胞活化模型中，酸敏感離子通道1α被激活并遷移到細胞膜上，導致細胞外Ca2+ 內流使細胞內Ca2+ 增加，它又可以誘發內質網應激，從而促進肝纖維化進展，并且該過程是PDGF由磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）通路激活酸敏感離子通道1α介導，進一步論證，抑制內質網應激后，磷酸化Akt、酸敏感離子通道1α、α-SMA和纖維化標志物Ⅰ型膠原的表達均被降低。在An等[54]的研究中發現，CaMKⅡ對PDGF誘導的肝星狀細胞增殖起正向作用，干擾、抑制CaMKⅡα表達后肝星狀細胞的增殖被顯著抑制，細胞周期抑制調節因子p53和p21表達增加，ERK磷酸化減弱，而對JNK磷酸化無影響，認為CaMKⅡ可通過ERK對PDGF誘導的肝星狀細胞增殖起正向調控作用。在另外研究[55]中，用CaMKⅡ特異性抑制劑KN93下調CaMKⅡ后，體內肝組織和體外培養肝星狀細胞中CaM、CaMKⅡ以及纖維化標志物Ⅰ型膠原、α-SMA和酸敏感離子通道1α的表達均降低，而過表達CaMKⅡ后可促進肝星狀細胞T6細胞的增殖，而沉默CaMKⅡ后則出現相反結果，提示了CaMKⅡ可能對肝星狀細胞增殖起促進作用。總之，在PDGF誘導肝星狀細胞增殖過程中，Ca2+介導了內質網應激的細胞凋亡，CaMKⅡ則可能是通過ERK1/2參與PDGF信號轉導過程而對肝星狀細胞增殖起正向調控作用，CaMKⅡ有可能成為肝纖維化的治療靶點。
3 總結與展望
肝星狀細胞的激活與增殖在肝纖維化過程中扮演著核心角色，它受多種因素和信號通路的共同影響，如Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路通過協同TGF-β1和PDGF相關途徑，對肝星狀細胞的增殖和凋亡調節起到關鍵作用，Ca2+ 促進肝星狀細胞凋亡；CaMKⅡ對肝星狀細胞雙向調控，既能促進肝星狀細胞增殖，又能誘導其凋亡，它是通過ERK通路促進肝星狀細胞增殖，而它對凋亡的促進作用則通過影響細胞內Ca2+ 的穩態實現。無論是通過TGF-β1還是PDGF途徑，肝星狀細胞的增殖促進作用均可通過CaMKⅡ/ERK通路實現，而且在此過程中，Ca2+ 均可通過介導內質網應激增加肝星狀細胞的凋亡，在通過PDGF途徑調控過程中Ca2+ 誘導肝星狀細胞凋亡可能是通過PI3K/Akt通路發揮作用，然而通過TGF-β1途徑調控過程中Ca2+ 誘導凋亡的具體途徑還需進一步研究。鑒于終末期肝纖維化或肝硬化給患者及其家庭帶來的嚴重負擔，且目前對Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路在肝纖維化進程中作用研究較少，相關認識仍存在不足，未來研究應聚焦于該信號通路在肝纖維化中的作用機制研究，特別是其上游基因或下游靶標蛋白，這將有助于制定出針對性強、效果顯著的治療策略，以期實現肝纖維化甚至肝硬化的逆轉，從而為患者提供更有效的治療選擇。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：劉雙飛負責文章撰寫及文獻檢索；冉江華負責文章評審及寫作指導；張熙冰對論文選題及修改給予指導；焦凌峰參與文獻檢索和資料收集。
肝纖維化是肝損傷后的創傷愈合發生的再生過程，在此過程中損傷因子持續存在，它可導致肝臟基質組織過量沉積和肝功能受損，至終末期時肝纖維化會發展為肝硬化。每年因肝硬化導致的肝功能失代償和肝細胞癌中約有200萬人死亡，占全球所有死亡人數的3.5%以上[1]。因此，對肝纖維化進行了解和干預意義重大。目前普遍認同肝纖維化是一個動態且可逆的過程[2]。鑒于此，避免肝纖維化進展為肝硬化，通過阻斷或逆轉肝纖維化的進程已成為治療肝臟疾病（簡稱“肝病” ）纖維化的核心內容。目前臨床上盡管已采用病因治療、肝細胞保護、抗氧化治療等對癥處理對肝纖維化進行干預，但仍未發現特異有效的抗肝纖維化的方法，因此對其機制及相關通路進行進一步深入了解仍有必要。現有相關研究發現，鈣離子（ionized free calcium，Ca2+）可通過鈣調蛋白（calmodulin，CaM）依賴的蛋白激酶Ⅱ（CaM dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）參與肝纖維化，它在肝纖維化中扮演重要角色[3]。現對Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路在肝纖維化中的作用研究的成果進行歸納總結，旨在為通過對該信號通路的干預防治臨床肝纖維化提供新思路。
1 肝纖維化及其機制
肝纖維化是脂肪性、病毒性、酒精性或非酒精性脂肪性等慢性肝病進展過程中的共同階段，是肝硬化發展的階段性病理表現，其病理特征為肝小葉中央區和匯管區有不同程度的纖維組織增生或纖維間隔形成，它主要涉及細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的產生及降解失衡[4]以及促炎和抗炎失衡。最常見的纖維化肝病是非酒精性脂肪性肝病和病毒性肝病，其中非酒精性脂肪性肝病常發展為非酒精性脂肪性肝炎[5]，在此過程中的主要病理學改變是肝小葉炎癥和肝細胞氣球樣變，脂毒性、氧化還原失衡、內質網應激、炎癥激活和細胞凋亡參與了此過程[6]；在病毒性肝病發展為病毒性肝炎過程中，非實質細胞在干擾素基因刺激因子作用下產生干擾素和促炎因子，從而啟動免疫反應抑制病毒復制，同時導致結締組織增生而造成肝細胞結構功能紊亂[7]，當受到病毒等病理因子刺激時肝臟發生免疫細胞聚集和炎癥激活，以啟動纖維化過程修復損傷，炎癥進一步激活肝星狀細胞轉化為肌成纖維細胞，從而分泌α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和肝細胞生長因子，加速肝纖維化形成[8-9]。當損傷為短期存在或自限性時，這一反應過程可被逆轉，肝臟結構可恢復正常；但是像酒精性、脂質性等慢性損傷因子持續存在或反復時，肝臟發生促炎與抗炎失衡和ECM產生及降解失衡。ECM穩態失衡會導致肝實質內纖維瘢痕增多、正常肝小葉結構被破壞，從而發生纖維化；而炎癥失衡則通過損傷肝功能而影響纖維化分期。
1.1 ECM產生及降解失衡
ECM穩態失衡是纖維化發生及發展中的重要狀態。成纖維細胞是ECM合成分泌的主要來源，其中肌成纖維細胞是一種假定的成纖維細胞亞型，它是纖維化反應的關鍵效應細胞，而大部分肌成纖維細胞由肝星狀細胞分化形成，肝星狀細胞在肝纖維化的發生及發展中起重要作用[10]。肝星狀細胞作為一種非實質細胞，在肝纖維化病理生理過程中能分泌ECM并參與膠原形成、合成基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和基質金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs），促進ECM產生和降解穩態失衡；此外，它還能調節肝竇內微循環推進纖維化進程。在靜息狀態下，肝星狀細胞位于Disse間隙，主要分泌Ⅳ型膠原纖維，當病毒、乙醇、脂質等各種病理因子持續刺激，導致巨噬細胞激活釋放細胞因子，在血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、胰島素樣生長因子-1、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等細胞因子誘導下肝星狀細胞被激活分化，同時發生遷移并移至損傷部位，增殖并轉化為成纖維細胞，合成大量ECM和Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的膠原纖維，并且上調TIMPs表達導致ECM的降解減少[1, 11]，從而造成ECM的產生及降解失衡；同時肌成纖維細胞內含有肌絲使得它兼有收縮功能，在肝損傷修復后期，這種收縮作用和ECM的過量產生共同作用破壞肝小葉結構，導致假小葉形成，從而引起肝臟發生纖維化。
1.2 促炎和抗炎失衡
炎癥是各種急慢性肝病進展的重要因素，炎癥應答最初是為了阻斷細菌、病毒等刺激，保護肝臟免受進一步損害，在這種應答過程中Kupffer細胞、肥大細胞等炎癥應答細胞激活產生了一系列細胞因子，這類細胞因子在誘導免疫細胞聚集清除損傷因素的同時也對肝星狀細胞產生造成一系列反應，從而加速或延緩肝纖維化的發生。Kupffer細胞是一種肝臟中特殊類型巨噬細胞，它在肝損傷時應答激活參與炎癥調控，其他類型巨噬細胞如M1和M2型巨噬細胞，M1型細胞在干擾素γ、脂多糖激活下分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ、白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6等促進炎癥發生損傷肝細胞；而M2型細胞在IL-4、IL-13作用下分泌IL-10發揮抗炎作用，但同時它也分泌TGF-β1、PDGF等細胞因子誘導肝星狀細胞活化促進肝纖維化進程[12]。TGF-β1和TNF-α作為多功能細胞因子，是肝纖維化刺激肝星狀細胞從靜止細胞活化為肌成纖維細胞的關鍵調節因子，它通過上調α-SMA介導肝星狀細胞轉分化為肌成纖維細胞和刺激Ⅰ型膠原和其他基質表達[13-14]，而TNF-α可通過激活核因子-κB、Bcl-XL和p21誘導活化肝星狀細胞抗凋亡，但它又能激活caspase-8產生促細胞凋亡[12]。此外，IL-17和IL-1是纖維化過程中兩個較為重要的炎癥因子，IL-17由另一種免疫應答細胞Th17細胞產生，它可誘導 Kupffer細胞和M1、M2型細胞產生IL-6、IL-1β、TNF-α、TGF-β1等細胞因子促進α-SMA和TGF-β1表達增加，從而作用于肝星狀細胞而實現炎癥反應和肝星狀細胞激活之間串聯[15-16]，IL-1則通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路中的核心成員c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38通路上調MMP-13和TIMP表達參與纖維化進程。另一類在纖維化中發揮作用的炎性細胞是肥大細胞，它可通過抑制MMP和促進其抑制劑TIMP抑制ECM降解參與纖維化調控[17]。由此可見，炎癥在肝纖維化中扮演了一個始動者作用，炎性細胞被激活后產生TNF-α、TGF-β、IL等細胞因子[18]，這些細胞因子在誘導肝星狀細胞活化的同時，還激活肝細胞保護、程序性死亡等信號傳導途徑調節肝臟損傷后自我修復，當這種修復作用超出其自身調節能力則引起炎癥失衡，進一步加重損傷并促進纖維化發展。
2 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路及它在肝纖維化過程中的作用
2.1 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路概述
Ca2+ 是細胞內不可或缺的第二信使，參與控制多種功能。內質網內Ca2+ 濃度變化參與蛋白質合成及無機物代謝，線粒體內Ca2+ 濃度調節參與三磷酸腺苷合成、三羧酸循環[19]、細胞凋亡[20]等。Ca2+ 濃度平衡是胞內“鈣庫”攝取和釋放鈣、跨細胞膜鈣離子轉運共同作用的結果。肝細胞內Ca2+ 濃度變化參與膽汁酸分泌、物質能量代謝、蛋白質合成和分泌、細胞周期調控、細胞增殖和程序性死亡、溶酶體、其他囊泡運動等幾乎所有肝細胞生理和病理過程[21-23]。
CaM是真核細胞內主要的Ca2+ 傳感器，是哺乳動物中Ca2+ 信號的主要轉導蛋白[24]，它在胞內無酶活性，通過作為Ca2+ 的轉運體和結合激活CaMKⅡ而發揮作用。細胞內Ca2+ 濃度的升高既能促進細胞增殖[25]，也能誘導細胞凋亡[26]，因此，CaM作為細胞內Ca2+ 的轉運體對細胞凋亡能發揮正向或負向的調節作用。CaM可能通過多種不同的機制調節細胞增殖，如CaM易位到細胞核并驅動血管平滑肌細胞的表型轉換[27]，CaM可通過與caspase相互作用而誘導肝星狀細胞凋亡[28]，CaM還能直接結合轉錄因子（CaM結合轉錄激活因子）參與多種組織中細胞的生長、分化調節[29]。
CaMK是Ca2+-CaM復合物調控的下游靶酶之一。CaMK是一個對多種細胞刺激產生反應的蛋白家族。多功能CaMK的成員包括CaMKⅠ、CaMKⅡ和CaMKⅣ[29-30]，其中CaMKⅡ包含 α、β、γ、δ 4種亞基和17種同工酶，它在哺乳動物全身各組織中均有廣泛表達，但在不同的組織中其表達量及亞基構成不一樣，如γ亞基在肝臟組織中的比例較高[31]。CaMKⅡ具有自激活功能，由鈣調素直接激活[32-33]。相關研究顯示，CaMKⅡ是細胞中Ca2+/CaM信號通路的下游效應蛋白，而CaMKⅡγ是細胞凋亡和自噬的上游調節因子，與Ca2+/CaM/CaMKⅡ結合可緩解CaMKⅡ家族酶的羧化結構域的自抑制作用，CaMKⅡ多聚、導致自磷酸化和相互磷酸化，從而延長激酶活性，觸發廣泛的信號傳導作用參與細胞凋亡[34-36]。大鼠肝移植缺血再灌注模型中，CaMKⅡγ與肝細胞肝酶異常、線粒體功能障礙和凋亡呈高度正相關[37]，這也證實了CaMKⅡγ可介導肝細胞發生凋亡和功能障礙。CaMKⅡ被廣泛證實參與器官纖維化。在腎臟中，CaMKⅡ可通過誘導細胞外調節激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）激活參與急性和慢性腎纖維化，抑制其表達后腎臟纖維化標志物蛋白、Ⅰ型膠原、MMP2和α-SMA的表達均被顯著抑制，腎臟纖維化明顯緩解[38]。同樣，在心臟纖維化研究中，抑制CaMKⅡ激活可延緩心肌不良重構并表現抗心律失常作用[39-40]。在肝纖維化中，CaMKⅡγ同樣被證實參與肝纖維化調控，且鑒于其上游Ca2+ 對肝臟的雙重調控作用，CaMKⅡγ對肝纖維化同樣表現為正、負向雙重調控。
2.2 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路在肝纖維化中的作用
肝纖維化是一個涉及多因素、多環節作用的、復雜的動態過程，肝星狀細胞的激活是肝纖維化發生、發展過程中的共同中心事件和關鍵步驟[41]，激活的肝星狀細胞通過增殖分泌大量ECM促進肝纖維化和通過細胞收縮而使肝竇內壓升高導致肝硬化與門靜脈高壓[42]。現階段關于肝纖維化發生機制的研究主要集中在TGF-β1信號轉導通路、PDGF信號轉導通路、Hippo信號通路、活性氧作用于肝星狀細胞的激活等方面[43]，而Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路主要通過TGF-β1和PDGF相關通路參與肝纖維化調控，對其纖維化調控主要表現在促進或抑制肝星狀細胞增殖和促進肝星狀細胞凋亡。
2.2.1 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路在TGF-β1調控肝纖維化中的作用
TGF-β1是當前最強促纖維化因子之一，TGF-β1/Smad信號轉導在纖維化中的作用已得到充分證實[44]。Smad蛋白家族是TGF-β1信號通路中下游的重要效應因子，其中Smad3和Smad4是促纖維化的，而Smad2和Smad7則負向調控肝纖維化。TGF-β1激活TGF-β受體Ⅰ型激酶，導致Smad2、Smad3磷酸化與Smad4復合物結合轉導信號至細胞核發揮生物學效應[45]。Smad3過度表達能夠抑制成纖維細胞中MMP-1活性而抑制ECM降解，Smad2和Smad7通過抑制Smad3信號對肝纖維化發揮負向作用[46-47]。此外，TGF-β1也能促進p65的磷酸化、甲硫氨酸腺苷轉移酶2A的轉錄表達和隨之而來的S-腺苷甲硫氨酸濃度降低來刺激肝星狀細胞活化。TGF-β1可通過多種細胞內信號轉導途徑如MAPK通路等參與肝星狀細胞的活化與增殖。ERK是MAPK家族一員，在TGF-β1誘導肝星狀細胞增殖實驗[48]中發現，ERK發生磷酸化呈現高表達狀態，然而在抑制CaMKⅡ表達后，這種磷酸化被減弱，提示CaMKⅡ/ERK信號通路是TGF-β1誘導肝星狀細胞增殖的重要調控信號通路。另一研究[49]結果顯示，TGF-β1可以誘導肝星狀細胞活化增殖，分別用低、中、高濃度CaMKⅡ抑制劑處理后，TGF-β1誘導的肝星狀細胞增殖呈逐步下降趨勢且肝星狀細胞凋亡率逐步增高，同時內質網應激途徑蛋白caspase-12高表達，這提示CaMKⅡ不僅可以通過促進肝星狀細胞增殖，還可以通過介導內質網應激誘導肝星狀細胞凋亡參與肝纖維化調控。與此同時，在體外肝星狀細胞誘導中，增加細胞內Ca2+ 濃度后，肝星狀細胞出現不同程度凋亡，且內質網應激途徑標志蛋白葡萄糖調節蛋白-78和caspase-12表達明顯上調[26]，這提示Ca2+ 可能通過增加內質網應激誘導肝星狀細胞凋亡。由此可見，Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路通過在TGF-β1/MAPK活化肝星狀細胞過程中發揮作用而參與肝纖維化調控。
2.2.2 Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路在PDGF調控肝纖維化中的作用
PDGF被認為是最有效的促有絲分裂原之一，是肝纖維化最有效的增殖因子，它激活細胞內信號，Ca2+ 信號參與了PDGF通路，而Ca2+/CaMKⅡ對人類肝星狀細胞的增殖至關重要。外源性PDGF可以激活MAPK信號通路，該信號通路的3個核心成員ERK1/2、JNK和p38均參與了對肝星狀細胞活化、增殖、凋亡的調控而參與肝纖維化的形成[50-52]。有研究[53]顯示，在PDGF誘導肝星狀細胞活化模型中，酸敏感離子通道1α被激活并遷移到細胞膜上，導致細胞外Ca2+ 內流使細胞內Ca2+ 增加，它又可以誘發內質網應激，從而促進肝纖維化進展，并且該過程是PDGF由磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）通路激活酸敏感離子通道1α介導，進一步論證，抑制內質網應激后，磷酸化Akt、酸敏感離子通道1α、α-SMA和纖維化標志物Ⅰ型膠原的表達均被降低。在An等[54]的研究中發現，CaMKⅡ對PDGF誘導的肝星狀細胞增殖起正向作用，干擾、抑制CaMKⅡα表達后肝星狀細胞的增殖被顯著抑制，細胞周期抑制調節因子p53和p21表達增加，ERK磷酸化減弱，而對JNK磷酸化無影響，認為CaMKⅡ可通過ERK對PDGF誘導的肝星狀細胞增殖起正向調控作用。在另外研究[55]中，用CaMKⅡ特異性抑制劑KN93下調CaMKⅡ后，體內肝組織和體外培養肝星狀細胞中CaM、CaMKⅡ以及纖維化標志物Ⅰ型膠原、α-SMA和酸敏感離子通道1α的表達均降低，而過表達CaMKⅡ后可促進肝星狀細胞T6細胞的增殖，而沉默CaMKⅡ后則出現相反結果，提示了CaMKⅡ可能對肝星狀細胞增殖起促進作用。總之，在PDGF誘導肝星狀細胞增殖過程中，Ca2+介導了內質網應激的細胞凋亡，CaMKⅡ則可能是通過ERK1/2參與PDGF信號轉導過程而對肝星狀細胞增殖起正向調控作用，CaMKⅡ有可能成為肝纖維化的治療靶點。
3 總結與展望
肝星狀細胞的激活與增殖在肝纖維化過程中扮演著核心角色，它受多種因素和信號通路的共同影響，如Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路通過協同TGF-β1和PDGF相關途徑，對肝星狀細胞的增殖和凋亡調節起到關鍵作用，Ca2+ 促進肝星狀細胞凋亡；CaMKⅡ對肝星狀細胞雙向調控，既能促進肝星狀細胞增殖，又能誘導其凋亡，它是通過ERK通路促進肝星狀細胞增殖，而它對凋亡的促進作用則通過影響細胞內Ca2+ 的穩態實現。無論是通過TGF-β1還是PDGF途徑，肝星狀細胞的增殖促進作用均可通過CaMKⅡ/ERK通路實現，而且在此過程中，Ca2+ 均可通過介導內質網應激增加肝星狀細胞的凋亡，在通過PDGF途徑調控過程中Ca2+ 誘導肝星狀細胞凋亡可能是通過PI3K/Akt通路發揮作用，然而通過TGF-β1途徑調控過程中Ca2+ 誘導凋亡的具體途徑還需進一步研究。鑒于終末期肝纖維化或肝硬化給患者及其家庭帶來的嚴重負擔，且目前對Ca2+/CaM/CaMKⅡ信號通路在肝纖維化進程中作用研究較少，相關認識仍存在不足，未來研究應聚焦于該信號通路在肝纖維化中的作用機制研究，特別是其上游基因或下游靶標蛋白，這將有助于制定出針對性強、效果顯著的治療策略，以期實現肝纖維化甚至肝硬化的逆轉，從而為患者提供更有效的治療選擇。
重要聲明
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作者貢獻聲明：劉雙飛負責文章撰寫及文獻檢索；冉江華負責文章評審及寫作指導；張熙冰對論文選題及修改給予指導；焦凌峰參與文獻檢索和資料收集。