引用本文： 夏宇, 考吾沙爾·巴合提江. 應用宏基因組二代測序技術分析慢性阻塞性肺疾病患者合并下呼吸道感染的BALF中微生物群落分布和載量. 中國呼吸與危重監護雜志, 2024, 23(6): 414-422. doi: 10.7507/1671-6205.202312059 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國呼吸與危重監護雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD，簡稱慢阻肺）是一種常見的慢性氣道疾病，其特征包括持續性氣道炎癥、小氣道阻塞和肺泡結構破壞。目前，慢阻肺已成為嚴重的公共衛生問題，同時也是全球疾病負擔的主要貢獻者之一。全球超過3億人患有慢阻肺 ，每年導致數百萬人死亡[1]。而單純肺炎患者和慢阻肺患者合并下呼吸道感染是兩種不同類型的呼吸系統疾病。單純肺炎通常是由細菌或病毒引起的急性炎癥反應，而慢阻肺合并下呼吸道感染則是指在慢性氣道疾病的基礎上發生的肺炎[2]。Chen等[3]研究提出，患有慢性氣道疾病的患者與單純肺炎患者在微生物組成上存在差異。另一篇文章也指出生物菌群結構及多樣性改變與疾病嚴重程度、病情惡化、炎癥程度和治療方案等因素相關[4]。支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）宏基因組二代測序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）作為一種有效的檢測方法，可以更加全面、快速、準確地反映下呼吸道的微生物群分布情況，對明確肺炎病原體具有重要意義[5]。常見的mNGS 報告病原體陽性鑒定標準有相對豐度、每百萬有效測序序列數（reads per million，RPM）及嚴格映射讀數（SDSMRN）等，在一項隊列研究中，RPM 比率標準表現更好，在識別細菌、真菌和病毒方面具有更高的準確性[6]。該研究還發現RPM可以廣泛用于臨床醫生的mNGS結果解釋，并且RPMsample/RP- MNTC技術無論病原體分類如何，比率標準均優于其他標準[6]。目前，我國基于高通量測序的慢阻肺合并下呼吸道感染相關研究較少，本研究通過分析慢阻肺合并下呼吸道感染患者與單純肺炎患者BALF菌群分布差異及微生物載量與感染程度之間的關系，為早期診斷提供參考依據，從而指導在緊急情況下的經驗治療。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取2021年12月—2023年3月新疆醫科大學第一附屬醫院收住入院經臨床診斷為肺炎的患者，根據納入及排除標準本研究共納入97例研究對象，包括單純肺炎患者52例，慢阻肺合并下呼吸道感染患者45例。所有患者均行BALF的mNGS 檢測及常規微生物學檢測（conventional microbiological tests，CMTs）。收集患者一般資料，包括年齡、性別、吸煙史及mNGS報告（結論與RPM值）。根據基礎疾病分為單純肺炎組（既往無基礎疾病史）和慢阻肺合并下呼吸道感染組（合并阻塞性肺疾病，而無其他系統合并癥）。分別在兩組中根據重癥肺炎診斷標準再分為重癥肺炎及非重癥肺炎兩個亞組。本研究將分枝桿菌屬、諾卡菌屬、衣原體/支原體屬等病原體歸為其他微生物類型。本研究通過新疆醫科大學第一附屬醫學倫理委員會批準（編號K202310-10）。
1.2 方法
1.2.1 社區獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）臨床診斷標準
（1）社區發病。（2）相關臨床表現：① 新近出現的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病癥狀加重，伴或不伴膿痰、胸痛、呼吸困難及咯血；② 發熱；③ 肺實變體征和（或） 聞及濕啰音；④ 外周血白細胞>10×109/L或<4×109/L，伴或不伴細胞核左移。（3）胸部影像學檢查：顯示新出現的斑片狀浸潤影、葉或段實變影、磨玻璃影或間質性改變，伴或不伴胸腔積液。符合（1）與（3），以及（2）中的任何 1 項，并除外肺結核、肺部腫瘤、非感染性肺間質性疾病、肺水腫、肺不張、肺栓塞、肺嗜酸粒細胞浸潤癥及肺血管炎等，可建立臨床診斷[7]。
1.2.2 醫院獲得性肺炎（hospital-acquired pneumonia， HAP）/呼吸機相關性肺炎（ventilator-associated pneumonia，VAP）
臨床診斷標準：HAP 是指患者住院期間沒有接受有創機械通氣、未處于病原感染的潛伏期，而于入院 48 h 后新發生的肺炎。VAP 是指氣管插管或氣管切開患者接受機械通氣 48 h后發生的肺炎，機械通氣撤機、拔管后48 h內出現的肺炎也屬于VAP范疇。HAP/VAP 臨床診斷標準[8]：胸部 X 線或CT顯示新出現或進展性的浸潤影、實變影或磨玻璃影，同時具有下列 3 種臨床癥候中的 2 種或以上，可建立臨床診斷：（1）體溫>38 ℃；（2）膿性氣道分泌物；（3）外周血白細胞計數>10×109 /L或<4×109 /L。
1.2.3 慢阻肺合并下呼吸道感染
慢阻肺合并下呼吸道感染是指慢阻肺患者因細菌、病毒或其他病原體感染而出現的急性加重癥狀。這種情況通常涉及支氣管和/或肺部，導致癥狀明顯加劇。慢阻肺 的診斷標準參考《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）》[9]，下呼吸道感染的診斷標準參考《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南（2016 年版）》[7]。
1.2.4 重癥肺炎
符合 2019 年美國感染病學會/美國胸科學會《成人社區獲得性肺炎診治指南》中關于重癥肺炎的相關診斷[10]，即符合以下1 項主要標準或至少 3 項次要標準可診斷為重癥肺炎。主要標準：（1）膿毒癥休克經積極液體復蘇后仍需血管活性藥物治療；（2）需行氣管插管進行機械通氣治療。次要標準：（1）體溫<36℃；（2）血小板計數<100×109/L；（3）白細胞計數<4×109/L；（3）氧合指數≤250 mm Hg；（3）呼吸頻率≥30 次/min；（4）血尿素氮≥20 mg/dL；（5）意識障礙；（6）多肺葉受累；（7）低血壓需液體復蘇。
1.2.5 納入及排除標準
納入標準：（1）年齡≥ 18歲；（2）符合CAP/HAP/VAP診斷標準；（3）同時完善 BALF mNGS 及CMTs。排除標準：（1）對纖支鏡檢查存在相關禁忌者；（2）排除慢阻肺以外的慢性病，如心血管疾病、糖尿病、肺癌、免疫系統疾病等；（3）臨床信息不全。需要強調的是，臨床醫生需要依據患者病情、臨床表現、影像學檢查、經驗，甚至多學科會診，全面分析 mNGS 結果，最終確定致病病原體。
1.3 mNGS檢測
1.3.1 BALF標本處理和測序
BALF標本檢測程序按照標準安全規程進行，將采集完的BALF標本送往杭州杰毅醫學檢驗實驗室有限公司。首先，利用生物樣品均質儀對BALF樣本中微生物的細胞壁進行破碎，以提高后續核酸提取的效率。從每個樣本中取1.2 mL置于震蕩管中進行均質處理。之后，采用核酸提取試劑盒（磁珠法）和全自動核酸提取儀，從樣本中提取DNA和RNA。對于RNA樣本，進行逆轉錄以生成cDNA。通過mNGS技術，無偏移地測序樣本中的所有核酸，從而分析樣本中存在的微生物組。為確保測序質量，每次測序都包括一個不含任何DNA或RNA的陰性對照和一個包含已知滅活微生物的陽性對照，以監控實驗過程中的潛在污染和驗證測序流程的準確性。
1.3.2 數據庫的建立
在本研究中，我們采用標準的文庫構建流程進行核酸的片段化、末端修復、A尾添加和接頭（index）連接，以構建適用于Illumina Nextseq?高通量測序平臺的文庫。我們計劃通過這一平臺進行測序，以獲得大量的序列數據，雖然預期每個文庫能產生約2 000萬條序列數據，實際數據量可能根據測序配置和需求有所不同。序列數據將經過生物信息學分析，包括去除人類基因組數據和與微生物參考數據庫的比對。我們將使用專業的病原微生物基因數據分析軟件處理這些數據，首先過濾掉匹配到人類參考基因組GRCh38.p13的序列，然后將剩余的序列與NCBI GenBank以及我們內部策劃的微生物基因組數據庫比對。這個數據庫包含超過35 257種病原微生物的信息。
1.3.3 mNGS匯報規則
① 序列數據滿足質控要求（文庫濃度>50 pM，Q20>85%，Q30>80%）；② 陰性對照 （NC）在同一張芯片中未檢測到該物種或RPM（樣本）/ RPM （NC）≥5，這是根據以往的研究經驗確定的，作為從背景污染中區分真陽性的閾值。
1.3.4 mNGS陽性結果的標準
① 臨床常見機會致病微生物、臨床非典型呼吸道機會致病菌、臨床非典型呼吸道機會致病菌，該復合群或物種為屬第一或與屬第一RPM相差5倍以內，且序列數≥10；② 檢出常見的呼吸道定植菌，若其所在屬的相對豐度超過50%；③ 臨床關注肺膿腫或明確厭氧菌感染的患者，定植菌中屬排名前5位的定植菌相加屬≥50%；④ 檢出下列CAP和HAP常見的致病病原體，即使所在屬的相對豐度在該文庫中所有微生物屬的排位中在10位之后，只要排除hopping和污染，均放入疑似列表；⑤ 真菌：念珠菌屬所在屬的序列數≥200；耶氏肺孢子菌序列數>50；呼吸道常見致病真菌++、或真菌，且序列數≥10；⑥ 病毒：檢出皰疹病毒（除8型外）時，序列數≥200；⑦ 寄生蟲：序列數≥50。
1.4 統計學方法
采用SPSS 26.0、 GraphPad Prism 8.0統計軟件進行數據處理及繪圖。計數資料用例數和百分比表示，比較采用皮爾森χ2 檢驗（不超過 20% 的格子理論頻數或期望頻數 T<5）。對計量指標進行正態性檢驗及方差齊性檢驗，滿足正態分布及方差齊性的計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較用獨立樣本 t 檢驗。Mann-Whitney U 檢驗用于比較兩組間微生物菌群RPM值之間的差異。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料
共納入97例肺炎患者，單純肺炎組52例，平均年齡53.60歲，其中男性31例。慢阻肺合并下呼吸道感染組45例，平均年齡65.73歲，其中男性26例。兩組年齡和吸煙指數差異有統計學意義（P<0.05），在性別、mNGS陽性率、重癥肺炎方面差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表1。
表表 1
患者的一般臨床信息特征
2.2 微生物分析
2.2.1 微生物總體分布特征
在97例肺炎患者的測序結果中，mNGS微生物陽性患者有80例（81.82%），對兩組檢測到的所有微生物在屬與種水平分布進行比較。屬水平比較：單純肺炎組在屬水平檢出19種微生物，細菌有8種（42.11%），檢出頻率最多的是不動桿菌屬、棒狀桿菌屬；真菌2種（10.53%），分別是假絲酵母菌屬、肺孢子菌屬；病毒3種（15.79%），分別是單純皰疹病毒屬、巨細胞病毒屬及淋巴隱病毒屬；其他類型微生物6種（31.58%），檢出頻率最多的是分枝桿菌屬和諾卡菌屬。而慢阻肺合并下呼吸道感染組在屬水平檢出22種微生物，細菌有10種（47.62%），檢出頻率最多的假單胞菌屬和鏈球菌屬；真菌3種（14.29%），分別是假絲酵母菌屬、肺孢子菌屬和曲霉菌屬；病毒4種（19.05%），分別是腸道病毒屬、淋巴隱病毒屬、β多瘤病毒屬和單純皰疹病毒屬；其他類型微生物4種（19.05%），檢出頻率最多的是分枝桿菌和諾卡菌屬。檢出種類、數量及比例見圖1a與圖2。在種水平比較：單純肺炎組在種水平檢出23種微生物，細菌有9種（39.13%），檢出頻率最多的是鮑曼不動桿菌和紋帶棒狀桿菌；真菌2種（8.70%），分別是白色假絲酵母菌和耶氏肺孢子菌；病毒3種（13.04%），分別是人皰疹病毒1型、4型、5型；其他類型微生物9種（39.13%），檢出頻率最多的是結核分枝桿菌復合群和鸚鵡熱衣原體。而慢阻肺合并下呼吸道感染組在種水平檢出30種微生物，細菌有12種（38.71%），檢出頻率最多的是銅綠假單胞菌；真菌9種（29.03%），檢出頻率最多的是白色假絲酵母菌和煙曲霉；病毒5種（12.90%），檢出頻率最多的是人皰疹病毒4型；其他類型微生物6種（19.35%），檢出頻率最多的是結核分枝桿菌復合群。檢出種類、數量及比例見圖1b與圖3。
2.2.2 不同感染類型微生物RPM值比較
不同程度肺炎的微生物在屬和種水平存在一定的差異。在屬水平的比較結果發現，在非重癥肺炎中，慢阻肺合并下呼吸道感染組細菌RPM值顯著高于單純肺炎組（Z=–2.706，P=0.007）；對于真菌、病毒，慢阻肺合并下呼吸道感染組RPM值高于單純肺炎組；對于其他微生物，單純肺炎組RPM值高于慢阻肺合并下呼吸道感染組，但差異均無統計學意義。在種水平非重癥肺炎，對于真菌、病毒，慢阻肺合并下呼吸道感染組RPM值高于單純肺炎組，對于細菌、其他微生物，單純肺炎組RPM值高于慢阻肺合并下呼吸道感染組，但差異均無統計學意義。結果見表2。在重癥肺炎中，在屬和種水平，對于細菌、其他微生物，慢阻肺合并下呼吸道感染組RPM值高于單純肺炎組；對于真菌、病毒，單純肺炎組RPM值高于慢阻肺合并下呼吸道感染組，但差異均無統計學意義。結果見表3。
表表 2
兩組非重癥肺炎微生物RPM值比較
表表 3
兩組重癥肺炎微生物RPM值比較
2.2.3 不同亞組微生物RPM值比較
不論在屬水平還是在種水平，單純肺炎組的重癥肺炎細菌RPM值顯著高于非重癥肺炎組（Z=?2.202，P=0.028；Z=?2.141，P=0.032）。結果見表4。慢阻肺合并重癥肺炎時細菌RPM值只有在種水平顯著高于非重癥肺炎（Z=?2.367，P=0.017）。結果見表5。不論在單純肺炎組還是在慢阻肺合并下呼吸道感染組，真菌、病毒RPM值在屬和種水平重癥肺炎高于非重癥肺炎；其他微生物RPM值在屬和種水平非重癥肺炎高于重癥肺炎，但差異均無統計意義。
表表 4
單純肺炎組微生物RPM值比較
表表 5
慢阻肺合并下呼吸道感染組微生物RPM比較
3 討論
肺炎是臨床上最常見的感染性疾病之一， 由肺炎引起的急性缺氧性呼吸衰竭是患者收治重癥監護室的主要原因 。如何早期、快速診斷病原體，從而精準用藥，縮短住院時間，減少并發癥及降低病死率至關重要。BALF相比其他類型標本，能更好地反映下呼吸道菌群分布，結合mNGS的高靈敏度、無偏移檢測及病原體覆蓋度廣等優勢[11]，BALF的mNGS檢測技術在肺炎微生物檢測方面表現出較好的臨床診斷效能[12]。
本研究以BALF的mNGS為基礎，比較單純肺炎組與慢阻肺合并下呼吸道感染組下呼吸道微生物分布特征，結果發現在97例肺炎患者的測序結果中，微生物陽性患者有80例（81.82%）。本研究發現，慢阻肺合并下呼吸道感染組吸煙指數顯著高于單純肺炎組（t=?3.62，P=0.001），有研究發現吸煙和氣流受限會增加假單胞菌屬和鏈球菌屬感染風險[13-15]。在本研究中，慢阻肺合并下呼吸道感染組中有59.46%的吸煙患者，而且75.68%患者明確存在氣流受限，本研究在屬水平優勢細菌為假單胞菌屬、鏈球菌屬，與上述研究結果一致。
不論在單純肺炎組還是在慢阻肺合并下呼吸道感染組，在屬水平和種水平檢出頻率最多的是細菌，但細菌屬種類并不相同，在單純肺炎患者最常見的菌屬不動桿菌屬，與Huang等[16]的研究結果不同，可能由于本研究單純肺炎組納入的患者因車禍、骨折等因素收住重癥監護室或者在外院經驗性抗生素抗感染治療欠佳后轉入我院。還發現不同微生物在種分布上存在差異，在種水平單純肺炎組最常見的是結核分枝桿菌，可能是因為我國仍屬于發展中國家，而且新疆地區本來就是肺結核高發地區，這與其他研究結果相似[15，17-18]。慢阻肺合并下呼吸道感染組檢出頻率最高的是銅綠假單胞菌，反復肺炎、長期住院史以及接受有創呼吸機輔助呼吸等均是銅綠假單胞菌感染的危險因素，尤其是耐藥菌的感染[19-20]。
曲霉、假絲酵母菌、耶氏肺孢子菌在慢阻肺合并下呼吸道感染組中的檢出率較高，在種類和數量上遠超過單純肺炎組，這也進一步證實了慢阻肺等慢性氣道疾病會增加真菌感染的風險，與Chen等[3]對220例疑似肺炎患者的研究結果一致。單純皰疹病毒1型和5型在單純肺炎組中檢出率較高，病毒在多數情況下（83.33%）是與其他微生物混合感染，而混合感染會明顯增加疾病的嚴重程度，這也提示我們在臨床工作應認識到多種微生物感染的重要性。本研究中，3例重癥感染患者鑒定為鸚鵡熱衣原體感染，鸚鵡熱衣原體肺炎是一種動物源性感染性疾病，感染后部分患者不典型起病，尤其在老年患者中，上呼吸道感染癥狀不明顯，發熱不典型，較易誤診，很容易發展成重癥肺炎危及生命[21]。近年來，越來越多的研究證實肺諾卡菌病會發生在患有肺部基礎疾病患者中[22]，在我們的研究中檢出7例諾卡菌患者中有5例既往或者入院后診斷患有慢阻肺等肺基礎疾病。提示臨床醫生在遇到不明原因的肺炎患者時，不能排除這些少見的致病病原體。
在本研究中，我們使用RPM值代表微生物檢出載量，為進一步探索微生物載量與慢阻肺和感染程度之間的關系，我們將兩組根據感染程度再分亞組，即重癥肺炎和非重癥肺炎，結果發現在非重癥肺炎組中，慢阻肺合并下呼吸道感染組細菌RPM值在屬水平顯著高于單純肺炎組，差異有統計學意義，這說明，慢阻肺等慢性氣道疾病可能會增加微生物RPM值。單純肺炎組重癥肺炎細菌RPM值在屬和種水顯著高于非重癥感染組；而慢阻肺合并重癥肺炎時細菌RPM值在屬和種水平也高于非重癥肺炎，但屬水平差異無統計學意義，本研究中的差異不顯著可能與樣本量較少有關，但也可以說明微生物RPM值可能與感染嚴重程度有關系，即載量越高，感染越重。對于真菌，不論在慢阻肺合并下呼吸道感染組還是在單純肺炎組，RPM值均較小，各亞組間的差異也沒有統計學意義，考慮與真菌在mNGS測序過程中需要破壁導致其載量減低相關[20，23]，因此在臨床中不能忽視對低載量真菌感染的診斷。
研究表明一種微生物的存在可能會促進或抑制其他微生物的定植[24-25]。在我們研究中，從整體水平來說，病毒RPM值與其他微生物RPM值在各亞組中的大小恰恰相反。對于病毒，重癥感染RPM值高于非重癥感染，慢阻肺合并下呼吸道感染組RPM值高于單純肺炎組；而其他類型微生物，如分枝桿菌和諾卡菌屬等，非重癥感染RPM值高于重癥感染，單純肺炎組高于慢阻肺合并下呼吸道感染組，這可能與重癥感染及多種微生物混合感染會影響不同微生物載量有關。因此需要更多臨床研究證明，肺炎時病毒載量的增加或不典型微生物載量的減少是否能提示判斷感染程度加重。這是第一份使用RPM值載量探索RPM值與慢阻肺和感染程度的研究，RPM值可在mNGS報告中得到，同時對于本研究結果需要更多研究證實其RPM值對疾病炎癥程度的效能。
本研究還存在以下不足：（1）本研究為回顧性，可能存在信息偏移；（2）樣本量相對較少；（3）微生物研究個體差異較大，容易受到氣候、環境及地區因素干擾；（4）在慢阻肺組中部分患者同時患有支氣管擴張癥及支氣管哮喘等其他肺部疾病，這可能會影響其結果的可靠性與準確性，未來需要更大規模的研究結合臨床感染指標進一步分析RPM值與慢阻肺和肺炎嚴重程度的關系，從而指導臨床治療。
綜上所述，本研究通過BALF的mNGS檢測技術，對單純肺炎及慢阻肺合并下呼吸道感染患者的BALF菌群分布特征分析，發現細菌為最主要的微生物，但兩組優勢細菌類型并不相同，單純肺炎組與慢阻肺合并下呼吸道感染組的優勢細菌分別為不動桿菌屬和假單胞菌屬。非典型微生物在單純肺炎組占比較高，而真菌更多見于慢阻肺合并下呼吸道感染組，這種菌群分布上的差異提示，在臨床工作中，對于單純肺炎患者除了經驗性覆蓋治療以外，不能忽視非典型微生物的感染，而mNGS對于非典型病原體診斷擁有獨特優勢；而對于慢阻肺合并下呼吸道感染患者應盡可能同步完善真菌相關檢查。此外，慢阻肺合并下呼吸道感染組的細菌RPM值顯著高于單純肺炎組，重癥肺炎細菌RPM值顯著高于非重癥肺炎，這種差異是否提示RPM值成為提示肺炎嚴重程度的預測指標，以及對于真菌和某些胞內細菌及病毒這些被認為是低載量微生物，是否有其他更好的mNGS指標提示肺炎嚴重程度，仍需進一步研究。
利益沖突：本文不涉及任何利益沖突
慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD，簡稱慢阻肺）是一種常見的慢性氣道疾病，其特征包括持續性氣道炎癥、小氣道阻塞和肺泡結構破壞。目前，慢阻肺已成為嚴重的公共衛生問題，同時也是全球疾病負擔的主要貢獻者之一。全球超過3億人患有慢阻肺 ，每年導致數百萬人死亡[1]。而單純肺炎患者和慢阻肺患者合并下呼吸道感染是兩種不同類型的呼吸系統疾病。單純肺炎通常是由細菌或病毒引起的急性炎癥反應，而慢阻肺合并下呼吸道感染則是指在慢性氣道疾病的基礎上發生的肺炎[2]。Chen等[3]研究提出，患有慢性氣道疾病的患者與單純肺炎患者在微生物組成上存在差異。另一篇文章也指出生物菌群結構及多樣性改變與疾病嚴重程度、病情惡化、炎癥程度和治療方案等因素相關[4]。支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）宏基因組二代測序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）作為一種有效的檢測方法，可以更加全面、快速、準確地反映下呼吸道的微生物群分布情況，對明確肺炎病原體具有重要意義[5]。常見的mNGS 報告病原體陽性鑒定標準有相對豐度、每百萬有效測序序列數（reads per million，RPM）及嚴格映射讀數（SDSMRN）等，在一項隊列研究中，RPM 比率標準表現更好，在識別細菌、真菌和病毒方面具有更高的準確性[6]。該研究還發現RPM可以廣泛用于臨床醫生的mNGS結果解釋，并且RPMsample/RP- MNTC技術無論病原體分類如何，比率標準均優于其他標準[6]。目前，我國基于高通量測序的慢阻肺合并下呼吸道感染相關研究較少，本研究通過分析慢阻肺合并下呼吸道感染患者與單純肺炎患者BALF菌群分布差異及微生物載量與感染程度之間的關系，為早期診斷提供參考依據，從而指導在緊急情況下的經驗治療。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取2021年12月—2023年3月新疆醫科大學第一附屬醫院收住入院經臨床診斷為肺炎的患者，根據納入及排除標準本研究共納入97例研究對象，包括單純肺炎患者52例，慢阻肺合并下呼吸道感染患者45例。所有患者均行BALF的mNGS 檢測及常規微生物學檢測（conventional microbiological tests，CMTs）。收集患者一般資料，包括年齡、性別、吸煙史及mNGS報告（結論與RPM值）。根據基礎疾病分為單純肺炎組（既往無基礎疾病史）和慢阻肺合并下呼吸道感染組（合并阻塞性肺疾病，而無其他系統合并癥）。分別在兩組中根據重癥肺炎診斷標準再分為重癥肺炎及非重癥肺炎兩個亞組。本研究將分枝桿菌屬、諾卡菌屬、衣原體/支原體屬等病原體歸為其他微生物類型。本研究通過新疆醫科大學第一附屬醫學倫理委員會批準（編號K202310-10）。
1.2 方法
1.2.1 社區獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）臨床診斷標準
（1）社區發病。（2）相關臨床表現：① 新近出現的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病癥狀加重，伴或不伴膿痰、胸痛、呼吸困難及咯血；② 發熱；③ 肺實變體征和（或） 聞及濕啰音；④ 外周血白細胞>10×109/L或<4×109/L，伴或不伴細胞核左移。（3）胸部影像學檢查：顯示新出現的斑片狀浸潤影、葉或段實變影、磨玻璃影或間質性改變，伴或不伴胸腔積液。符合（1）與（3），以及（2）中的任何 1 項，并除外肺結核、肺部腫瘤、非感染性肺間質性疾病、肺水腫、肺不張、肺栓塞、肺嗜酸粒細胞浸潤癥及肺血管炎等，可建立臨床診斷[7]。
1.2.2 醫院獲得性肺炎（hospital-acquired pneumonia， HAP）/呼吸機相關性肺炎（ventilator-associated pneumonia，VAP）
臨床診斷標準：HAP 是指患者住院期間沒有接受有創機械通氣、未處于病原感染的潛伏期，而于入院 48 h 后新發生的肺炎。VAP 是指氣管插管或氣管切開患者接受機械通氣 48 h后發生的肺炎，機械通氣撤機、拔管后48 h內出現的肺炎也屬于VAP范疇。HAP/VAP 臨床診斷標準[8]：胸部 X 線或CT顯示新出現或進展性的浸潤影、實變影或磨玻璃影，同時具有下列 3 種臨床癥候中的 2 種或以上，可建立臨床診斷：（1）體溫>38 ℃；（2）膿性氣道分泌物；（3）外周血白細胞計數>10×109 /L或<4×109 /L。
1.2.3 慢阻肺合并下呼吸道感染
慢阻肺合并下呼吸道感染是指慢阻肺患者因細菌、病毒或其他病原體感染而出現的急性加重癥狀。這種情況通常涉及支氣管和/或肺部，導致癥狀明顯加劇。慢阻肺 的診斷標準參考《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）》[9]，下呼吸道感染的診斷標準參考《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南（2016 年版）》[7]。
1.2.4 重癥肺炎
符合 2019 年美國感染病學會/美國胸科學會《成人社區獲得性肺炎診治指南》中關于重癥肺炎的相關診斷[10]，即符合以下1 項主要標準或至少 3 項次要標準可診斷為重癥肺炎。主要標準：（1）膿毒癥休克經積極液體復蘇后仍需血管活性藥物治療；（2）需行氣管插管進行機械通氣治療。次要標準：（1）體溫<36℃；（2）血小板計數<100×109/L；（3）白細胞計數<4×109/L；（3）氧合指數≤250 mm Hg；（3）呼吸頻率≥30 次/min；（4）血尿素氮≥20 mg/dL；（5）意識障礙；（6）多肺葉受累；（7）低血壓需液體復蘇。
1.2.5 納入及排除標準
納入標準：（1）年齡≥ 18歲；（2）符合CAP/HAP/VAP診斷標準；（3）同時完善 BALF mNGS 及CMTs。排除標準：（1）對纖支鏡檢查存在相關禁忌者；（2）排除慢阻肺以外的慢性病，如心血管疾病、糖尿病、肺癌、免疫系統疾病等；（3）臨床信息不全。需要強調的是，臨床醫生需要依據患者病情、臨床表現、影像學檢查、經驗，甚至多學科會診，全面分析 mNGS 結果，最終確定致病病原體。
1.3 mNGS檢測
1.3.1 BALF標本處理和測序
BALF標本檢測程序按照標準安全規程進行，將采集完的BALF標本送往杭州杰毅醫學檢驗實驗室有限公司。首先，利用生物樣品均質儀對BALF樣本中微生物的細胞壁進行破碎，以提高后續核酸提取的效率。從每個樣本中取1.2 mL置于震蕩管中進行均質處理。之后，采用核酸提取試劑盒（磁珠法）和全自動核酸提取儀，從樣本中提取DNA和RNA。對于RNA樣本，進行逆轉錄以生成cDNA。通過mNGS技術，無偏移地測序樣本中的所有核酸，從而分析樣本中存在的微生物組。為確保測序質量，每次測序都包括一個不含任何DNA或RNA的陰性對照和一個包含已知滅活微生物的陽性對照，以監控實驗過程中的潛在污染和驗證測序流程的準確性。
1.3.2 數據庫的建立
在本研究中，我們采用標準的文庫構建流程進行核酸的片段化、末端修復、A尾添加和接頭（index）連接，以構建適用于Illumina Nextseq?高通量測序平臺的文庫。我們計劃通過這一平臺進行測序，以獲得大量的序列數據，雖然預期每個文庫能產生約2 000萬條序列數據，實際數據量可能根據測序配置和需求有所不同。序列數據將經過生物信息學分析，包括去除人類基因組數據和與微生物參考數據庫的比對。我們將使用專業的病原微生物基因數據分析軟件處理這些數據，首先過濾掉匹配到人類參考基因組GRCh38.p13的序列，然后將剩余的序列與NCBI GenBank以及我們內部策劃的微生物基因組數據庫比對。這個數據庫包含超過35 257種病原微生物的信息。
1.3.3 mNGS匯報規則
① 序列數據滿足質控要求（文庫濃度>50 pM，Q20>85%，Q30>80%）；② 陰性對照 （NC）在同一張芯片中未檢測到該物種或RPM（樣本）/ RPM （NC）≥5，這是根據以往的研究經驗確定的，作為從背景污染中區分真陽性的閾值。
1.3.4 mNGS陽性結果的標準
① 臨床常見機會致病微生物、臨床非典型呼吸道機會致病菌、臨床非典型呼吸道機會致病菌，該復合群或物種為屬第一或與屬第一RPM相差5倍以內，且序列數≥10；② 檢出常見的呼吸道定植菌，若其所在屬的相對豐度超過50%；③ 臨床關注肺膿腫或明確厭氧菌感染的患者，定植菌中屬排名前5位的定植菌相加屬≥50%；④ 檢出下列CAP和HAP常見的致病病原體，即使所在屬的相對豐度在該文庫中所有微生物屬的排位中在10位之后，只要排除hopping和污染，均放入疑似列表；⑤ 真菌：念珠菌屬所在屬的序列數≥200；耶氏肺孢子菌序列數>50；呼吸道常見致病真菌++、或真菌，且序列數≥10；⑥ 病毒：檢出皰疹病毒（除8型外）時，序列數≥200；⑦ 寄生蟲：序列數≥50。
1.4 統計學方法
采用SPSS 26.0、 GraphPad Prism 8.0統計軟件進行數據處理及繪圖。計數資料用例數和百分比表示，比較采用皮爾森χ2 檢驗（不超過 20% 的格子理論頻數或期望頻數 T<5）。對計量指標進行正態性檢驗及方差齊性檢驗，滿足正態分布及方差齊性的計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較用獨立樣本 t 檢驗。Mann-Whitney U 檢驗用于比較兩組間微生物菌群RPM值之間的差異。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料
共納入97例肺炎患者，單純肺炎組52例，平均年齡53.60歲，其中男性31例。慢阻肺合并下呼吸道感染組45例，平均年齡65.73歲，其中男性26例。兩組年齡和吸煙指數差異有統計學意義（P<0.05），在性別、mNGS陽性率、重癥肺炎方面差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表1。
表表 1
患者的一般臨床信息特征
2.2 微生物分析
2.2.1 微生物總體分布特征
在97例肺炎患者的測序結果中，mNGS微生物陽性患者有80例（81.82%），對兩組檢測到的所有微生物在屬與種水平分布進行比較。屬水平比較：單純肺炎組在屬水平檢出19種微生物，細菌有8種（42.11%），檢出頻率最多的是不動桿菌屬、棒狀桿菌屬；真菌2種（10.53%），分別是假絲酵母菌屬、肺孢子菌屬；病毒3種（15.79%），分別是單純皰疹病毒屬、巨細胞病毒屬及淋巴隱病毒屬；其他類型微生物6種（31.58%），檢出頻率最多的是分枝桿菌屬和諾卡菌屬。而慢阻肺合并下呼吸道感染組在屬水平檢出22種微生物，細菌有10種（47.62%），檢出頻率最多的假單胞菌屬和鏈球菌屬；真菌3種（14.29%），分別是假絲酵母菌屬、肺孢子菌屬和曲霉菌屬；病毒4種（19.05%），分別是腸道病毒屬、淋巴隱病毒屬、β多瘤病毒屬和單純皰疹病毒屬；其他類型微生物4種（19.05%），檢出頻率最多的是分枝桿菌和諾卡菌屬。檢出種類、數量及比例見圖1a與圖2。在種水平比較：單純肺炎組在種水平檢出23種微生物，細菌有9種（39.13%），檢出頻率最多的是鮑曼不動桿菌和紋帶棒狀桿菌；真菌2種（8.70%），分別是白色假絲酵母菌和耶氏肺孢子菌；病毒3種（13.04%），分別是人皰疹病毒1型、4型、5型；其他類型微生物9種（39.13%），檢出頻率最多的是結核分枝桿菌復合群和鸚鵡熱衣原體。而慢阻肺合并下呼吸道感染組在種水平檢出30種微生物，細菌有12種（38.71%），檢出頻率最多的是銅綠假單胞菌；真菌9種（29.03%），檢出頻率最多的是白色假絲酵母菌和煙曲霉；病毒5種（12.90%），檢出頻率最多的是人皰疹病毒4型；其他類型微生物6種（19.35%），檢出頻率最多的是結核分枝桿菌復合群。檢出種類、數量及比例見圖1b與圖3。
2.2.2 不同感染類型微生物RPM值比較
不同程度肺炎的微生物在屬和種水平存在一定的差異。在屬水平的比較結果發現，在非重癥肺炎中，慢阻肺合并下呼吸道感染組細菌RPM值顯著高于單純肺炎組（Z=–2.706，P=0.007）；對于真菌、病毒，慢阻肺合并下呼吸道感染組RPM值高于單純肺炎組；對于其他微生物，單純肺炎組RPM值高于慢阻肺合并下呼吸道感染組，但差異均無統計學意義。在種水平非重癥肺炎，對于真菌、病毒，慢阻肺合并下呼吸道感染組RPM值高于單純肺炎組，對于細菌、其他微生物，單純肺炎組RPM值高于慢阻肺合并下呼吸道感染組，但差異均無統計學意義。結果見表2。在重癥肺炎中，在屬和種水平，對于細菌、其他微生物，慢阻肺合并下呼吸道感染組RPM值高于單純肺炎組；對于真菌、病毒，單純肺炎組RPM值高于慢阻肺合并下呼吸道感染組，但差異均無統計學意義。結果見表3。
表表 2
兩組非重癥肺炎微生物RPM值比較
表表 3
兩組重癥肺炎微生物RPM值比較
2.2.3 不同亞組微生物RPM值比較
不論在屬水平還是在種水平，單純肺炎組的重癥肺炎細菌RPM值顯著高于非重癥肺炎組（Z=?2.202，P=0.028；Z=?2.141，P=0.032）。結果見表4。慢阻肺合并重癥肺炎時細菌RPM值只有在種水平顯著高于非重癥肺炎（Z=?2.367，P=0.017）。結果見表5。不論在單純肺炎組還是在慢阻肺合并下呼吸道感染組，真菌、病毒RPM值在屬和種水平重癥肺炎高于非重癥肺炎；其他微生物RPM值在屬和種水平非重癥肺炎高于重癥肺炎，但差異均無統計意義。
表表 4
單純肺炎組微生物RPM值比較
表表 5
慢阻肺合并下呼吸道感染組微生物RPM比較
3 討論
肺炎是臨床上最常見的感染性疾病之一， 由肺炎引起的急性缺氧性呼吸衰竭是患者收治重癥監護室的主要原因 。如何早期、快速診斷病原體，從而精準用藥，縮短住院時間，減少并發癥及降低病死率至關重要。BALF相比其他類型標本，能更好地反映下呼吸道菌群分布，結合mNGS的高靈敏度、無偏移檢測及病原體覆蓋度廣等優勢[11]，BALF的mNGS檢測技術在肺炎微生物檢測方面表現出較好的臨床診斷效能[12]。
本研究以BALF的mNGS為基礎，比較單純肺炎組與慢阻肺合并下呼吸道感染組下呼吸道微生物分布特征，結果發現在97例肺炎患者的測序結果中，微生物陽性患者有80例（81.82%）。本研究發現，慢阻肺合并下呼吸道感染組吸煙指數顯著高于單純肺炎組（t=?3.62，P=0.001），有研究發現吸煙和氣流受限會增加假單胞菌屬和鏈球菌屬感染風險[13-15]。在本研究中，慢阻肺合并下呼吸道感染組中有59.46%的吸煙患者，而且75.68%患者明確存在氣流受限，本研究在屬水平優勢細菌為假單胞菌屬、鏈球菌屬，與上述研究結果一致。
不論在單純肺炎組還是在慢阻肺合并下呼吸道感染組，在屬水平和種水平檢出頻率最多的是細菌，但細菌屬種類并不相同，在單純肺炎患者最常見的菌屬不動桿菌屬，與Huang等[16]的研究結果不同，可能由于本研究單純肺炎組納入的患者因車禍、骨折等因素收住重癥監護室或者在外院經驗性抗生素抗感染治療欠佳后轉入我院。還發現不同微生物在種分布上存在差異，在種水平單純肺炎組最常見的是結核分枝桿菌，可能是因為我國仍屬于發展中國家，而且新疆地區本來就是肺結核高發地區，這與其他研究結果相似[15，17-18]。慢阻肺合并下呼吸道感染組檢出頻率最高的是銅綠假單胞菌，反復肺炎、長期住院史以及接受有創呼吸機輔助呼吸等均是銅綠假單胞菌感染的危險因素，尤其是耐藥菌的感染[19-20]。
曲霉、假絲酵母菌、耶氏肺孢子菌在慢阻肺合并下呼吸道感染組中的檢出率較高，在種類和數量上遠超過單純肺炎組，這也進一步證實了慢阻肺等慢性氣道疾病會增加真菌感染的風險，與Chen等[3]對220例疑似肺炎患者的研究結果一致。單純皰疹病毒1型和5型在單純肺炎組中檢出率較高，病毒在多數情況下（83.33%）是與其他微生物混合感染，而混合感染會明顯增加疾病的嚴重程度，這也提示我們在臨床工作應認識到多種微生物感染的重要性。本研究中，3例重癥感染患者鑒定為鸚鵡熱衣原體感染，鸚鵡熱衣原體肺炎是一種動物源性感染性疾病，感染后部分患者不典型起病，尤其在老年患者中，上呼吸道感染癥狀不明顯，發熱不典型，較易誤診，很容易發展成重癥肺炎危及生命[21]。近年來，越來越多的研究證實肺諾卡菌病會發生在患有肺部基礎疾病患者中[22]，在我們的研究中檢出7例諾卡菌患者中有5例既往或者入院后診斷患有慢阻肺等肺基礎疾病。提示臨床醫生在遇到不明原因的肺炎患者時，不能排除這些少見的致病病原體。
在本研究中，我們使用RPM值代表微生物檢出載量，為進一步探索微生物載量與慢阻肺和感染程度之間的關系，我們將兩組根據感染程度再分亞組，即重癥肺炎和非重癥肺炎，結果發現在非重癥肺炎組中，慢阻肺合并下呼吸道感染組細菌RPM值在屬水平顯著高于單純肺炎組，差異有統計學意義，這說明，慢阻肺等慢性氣道疾病可能會增加微生物RPM值。單純肺炎組重癥肺炎細菌RPM值在屬和種水顯著高于非重癥感染組；而慢阻肺合并重癥肺炎時細菌RPM值在屬和種水平也高于非重癥肺炎，但屬水平差異無統計學意義，本研究中的差異不顯著可能與樣本量較少有關，但也可以說明微生物RPM值可能與感染嚴重程度有關系，即載量越高，感染越重。對于真菌，不論在慢阻肺合并下呼吸道感染組還是在單純肺炎組，RPM值均較小，各亞組間的差異也沒有統計學意義，考慮與真菌在mNGS測序過程中需要破壁導致其載量減低相關[20，23]，因此在臨床中不能忽視對低載量真菌感染的診斷。
研究表明一種微生物的存在可能會促進或抑制其他微生物的定植[24-25]。在我們研究中，從整體水平來說，病毒RPM值與其他微生物RPM值在各亞組中的大小恰恰相反。對于病毒，重癥感染RPM值高于非重癥感染，慢阻肺合并下呼吸道感染組RPM值高于單純肺炎組；而其他類型微生物，如分枝桿菌和諾卡菌屬等，非重癥感染RPM值高于重癥感染，單純肺炎組高于慢阻肺合并下呼吸道感染組，這可能與重癥感染及多種微生物混合感染會影響不同微生物載量有關。因此需要更多臨床研究證明，肺炎時病毒載量的增加或不典型微生物載量的減少是否能提示判斷感染程度加重。這是第一份使用RPM值載量探索RPM值與慢阻肺和感染程度的研究，RPM值可在mNGS報告中得到，同時對于本研究結果需要更多研究證實其RPM值對疾病炎癥程度的效能。
本研究還存在以下不足：（1）本研究為回顧性，可能存在信息偏移；（2）樣本量相對較少；（3）微生物研究個體差異較大，容易受到氣候、環境及地區因素干擾；（4）在慢阻肺組中部分患者同時患有支氣管擴張癥及支氣管哮喘等其他肺部疾病，這可能會影響其結果的可靠性與準確性，未來需要更大規模的研究結合臨床感染指標進一步分析RPM值與慢阻肺和肺炎嚴重程度的關系，從而指導臨床治療。
綜上所述，本研究通過BALF的mNGS檢測技術，對單純肺炎及慢阻肺合并下呼吸道感染患者的BALF菌群分布特征分析，發現細菌為最主要的微生物，但兩組優勢細菌類型并不相同，單純肺炎組與慢阻肺合并下呼吸道感染組的優勢細菌分別為不動桿菌屬和假單胞菌屬。非典型微生物在單純肺炎組占比較高，而真菌更多見于慢阻肺合并下呼吸道感染組，這種菌群分布上的差異提示，在臨床工作中，對于單純肺炎患者除了經驗性覆蓋治療以外，不能忽視非典型微生物的感染，而mNGS對于非典型病原體診斷擁有獨特優勢；而對于慢阻肺合并下呼吸道感染患者應盡可能同步完善真菌相關檢查。此外，慢阻肺合并下呼吸道感染組的細菌RPM值顯著高于單純肺炎組，重癥肺炎細菌RPM值顯著高于非重癥肺炎，這種差異是否提示RPM值成為提示肺炎嚴重程度的預測指標，以及對于真菌和某些胞內細菌及病毒這些被認為是低載量微生物，是否有其他更好的mNGS指標提示肺炎嚴重程度，仍需進一步研究。
利益沖突：本文不涉及任何利益沖突
