引用本文： 朱鵬飛, 賴曉蓉, 熊沿, 肖祝. 蟛蜞菊內酯通過抑制AMPK/NLRP3/Caspase-1信號通路減輕脂多糖誘導的肺泡上皮細胞焦亡. 中國呼吸與危重監護雜志, 2024, 23(7): 488-494. doi: 10.7507/1671-6205.202402029 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國呼吸與危重監護雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
急性肺損傷是由多種致病因素導致的炎癥綜合征，主要表現為肺上皮細胞損傷，嚴重時可以引起細胞焦亡[1]。脂多糖（lipolyaccharide，LPS）作為革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分，可以引起急性肺損傷，常被用于構建肺損傷模型[2]。蟛蜞菊內酯（wedelactone，WEL）是菊科植物墨旱蓮的主要成分之一，具有抗炎、抗氧化等作用。研究顯示，WEL可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate activates protein kinase，AMPK）增加AMPK磷酸化水平，減少肺部炎癥細胞浸潤，減輕肺纖維化[3]。AMPK/核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（nucleotide-bound oligomerized domain-like receptor 3，NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）信號通路是細胞焦亡經典通路。研究顯示達格列凈可激活AMPK，抑制NLRP3、Caspase-1活化，發揮抗炎、抗氧化、抗焦亡作用，改善急性肺損傷[4]。但是WEL是否可以通過AMPK/NLRP3/Caspase-1信號通路，減輕LPS誘導的肺泡上皮細胞焦亡還有待進一步研究。本研究探索WEL對LPS誘導的肺泡上皮細胞焦亡及AMPK/NLRP3/Caspase-1信號通路的影響，為肺損傷的治療提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料
BEAS-2B細胞（Y-00805）購于上海酶研生物科技有限公司。LPS（L8880）購于上海恒斐生物科技有限公司。WEL（HPLC≥98%）購于上海吉至生化科技有限公司。AMPK抑制劑Compound C（HY-13418A）購于MCE公司。Caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK（HY-P1009）購于美國MedChemExpress公司。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）（PT518）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）（PI640）酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；熒光標記的山羊抗兔lgG（ab150077）購于上海abcam公司；Gasdermin家族蛋白（gasdermin family proteins，DGSDMD）（sc-393581）購于Santa Cruz Biotechnology公司；AMPK（ab32047）、NLRP3（ab263899）、Caspase-1（ab62698）單抗購于上海Abcam公司；GAPDH單抗（5174）購于美國Cell Signaling Technology公司。
1.2 方法
1.2.1 MTT法檢測細胞活性
在37℃、5% CO2培養箱中用含10%磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）的DMEM培養基培養BEAS-2B細胞，至細胞生長到對數期，用不同濃度的WEL處理BEAS-2B細胞，并將細胞置于37℃ 5% CO2培養箱培養2天，離心去上清，加入20 μL 5 g/L MTT溶液，37℃恒溫培養箱培養4 h，離心去上清，加入100 μL DMSO，渦旋振蕩，酶標儀測OD值。
1.2.2 細胞分組及處理
將肺泡上皮細胞BEAS-2B分為對照組、脂多糖組（LPS組）、10 μmol/L蟛蜞菊內酯組（WEL-L組）、20 μmol/L蟛蜞菊內酯組（WEL-M組）、40 μmol/L蟛蜞菊內酯組（WEL-H組）、40 μmol/L蟛蜞菊內酯+10 μmol/L AMPK抑制劑Compound C組（WEL-H+Compound C組）、20 μmol/L Caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK組（Z-YVAD-FMK組）。對照組細胞不做任何處理；LPS組細胞用濃度為10 μg/mL LPS處理24 h[5]；WEL-L組、WEL-M組和WEL-H組細胞用濃度為10 μg/mL LPS及分別用10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的WEL共培養處理24 h；WEL-H+Compound C組細胞用10 μg/mL LPS、40 μmol/L的WEL、10 μmol/L AMPK抑制劑Compound C[6]共培養處理24 h；Z-YVAD-FMK組細胞用10 μg/mL LPS、20 μmol/L Caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK[7]共培養處理24 h。
1.2.3 ELISA檢測炎癥因子
收集1.2.2制備的各組細胞培養基上清液，ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、IL-8水平。
1.2.4 細胞顯微結構觀察細胞超微結構
取1.2.2制備的各組細胞用胰酶消化后將細胞懸液移入離心管，離心棄上清，加入1 mL 2.5%戊二醛溶液固定細胞，制作電鏡切片，用透射電鏡觀察各組細胞超微結構。
1.2.5 免疫熒光檢測Caspase-1、DGSDMD蛋白表達
取含1.2.2各組細胞玻片放置在24孔板，每孔2×105個細胞，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.5% Triton X-100 4℃透膜5 min，含5% BSA的PBS室溫封閉1 h，分別加入一抗Caspase-1、GSDMD 4℃孵育過夜，再加入二抗山羊抗兔lgG（H+L）37℃孵育1 h。PI染核5 min，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，Image J軟件分析蛋白熒光強度。
1.2.6 Western blot法檢測AMPK、NLRP3、Caspase-1表達
取1.2.2制備的各組細胞加入RIPA細胞裂解液裂解蛋白，電泳分離，轉膜封閉。隨后加入一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育，ECL曝光，Image J軟件分析條帶灰度值。
1.3 統計學方法
采用SPSS 25.0進行統計分析，呈正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 WEL對BEAS-2B細胞活性的影響
與對照組相比，100 μmol/L及200 μmol/L的WEL處理后細胞活性顯著下降（P<0.05），而40 μmol/L及以下濃度的WEL對細胞活性無明顯影響（P>0.05），結果見表1。因此，選擇10、20、40 μmol/L的WEL不影響細胞活性的濃度進行后續實驗。
表1
WEL對BEAS-2B細胞活性的影響（n=6，x±s）
2.2 WEL對LPS誘導的BEAS-2B細胞活性的影響
隨著時間推移，除對照組，其余各組細胞存活率逐漸降低；與對照組相比，LPS組BEAS-2B細胞存活率顯著降低（P<0.05）；與LPS組相比，WEL-L組、WEL-M組、WEL-H組BEAS-2B細胞存活率依次顯著升高，Z-YVAD-FMK組細胞存活率顯著升高（P<0.05）；與WEL-H組相比，WEL-H+Compound C組細胞存活率顯著降低（P<0.05）。結果見圖1、表2。
圖1
各組細胞存活率比較
表2
WEL對LPS誘導的BEAS-2B細胞活性的影響（n=6，x±s）
2.3 WEL對LPS誘導的BEAS-2B細胞顯微結構的影響
對照組細胞內質網和線粒體形態飽滿；與對照組相比，LPS組細胞損傷嚴重，線粒體嵴斷裂且數量減少；與LPS組相比，WEL-L組、WEL-M組、WEL-H組細胞損傷依次減輕，內質網和線粒體嵴逐漸正常完整，Z-YVAD-FMK組細胞損傷不明顯，內質網與線粒體完整正常；與WEL-H組相比，WEL-H+Compound C組細胞損傷嚴重，線粒體嵴斷裂且數量減少。結果見圖2。
圖2
各組細胞透射電鏡像（×50 000）
a. 對照組；b. LPS組；c. WEL-L組；d. WEL-M組；e. WEL-H組；f. WEL-H+Compound C組；g. Z-YVAD-FMK組。
2.4 WEL對LPS誘導的BEAS-2B細胞TNF-α、IL-1β、IL-8水平的影響
與對照組相比，LPS組TNF-α、IL-1β、IL-8水平顯著上升（P<0.05）；與LPS組相比，WEL-L組、WEL-M組、WEL-H組TNF-α、IL-1β、IL-8水平依次顯著下降，Z-YVAD-FMK組TNF-α、IL-1β、IL-8水平顯著下降（P<0.05）；與WEL-H組相比，WEL-H+Compound C組TNF-α、IL-1β、IL-8水平顯著上升（P<0.05）。結果見表3。
表3
WEL對BEAS-2B細胞TNF-α、IL-1β、IL-8水平的影響（n=6，x±s）
2.5 WEL對LPS誘導的BEAS-2B細胞焦亡相關基因Caspase-1、GSDMD的影響
如圖3所示，Caspase-1、GSDMD染色呈紅色，DAPI染色呈藍色。與對照組相比，LPS組Caspase-1、GSDMD水平上升（P<0.05）；與LPS組相比，WEL-L組、WEL-M組、WEL-H組Caspase-1、GSDMD水平依次顯著下降，Z-YVAD-FMK組Caspase-1、GSDMD水平顯著下降（P<0.05）；與WEL-H組相比，WEL-H+Compound C組Caspase-1、GSDMD水平顯著上升（P<0.05）。結果見表4。
圖3
免疫熒光觀察各組細胞Caspase-1、GSDMD蛋白表達（×1 000）
表4
WEL對BEAS-2B細胞Caspase-1、GSDMD水平的影響（n=6，x±s）
2.6 WEL對AMPK/NLRP3/Caspase-1信號通路的影響
與對照組相比，LPS組p-AMPK/AMPK下降，NLRP3、Caspase-1蛋白表達上升（P<0.05）；與LPS組相比，WEL-L組、WEL-M組、WEL-H組p-AMPK/AMPK上升，NLRP3、Caspase-1蛋白表達依次下降，Z-YVAD-FMK組p-AMPK/AMPK表達上升，NLRP3、Caspase-1蛋白表達下降（P<0.05）；與WEL-H組相比，WEL-H+Compound C組p-AMPK/AMPK下降，NLRP3、Caspase-1蛋白表達上升（P<0.05）。結果見圖4和表5。
圖4
Western blot檢測AMPK/NLRP3/Caspase-1通路相關蛋白表達
a. 對照組；b. LPS組；c. WEL-L組；d. WEL-M組；e. WEL-H組；f. WEL-H+Compound C組；g. Z-YVAD-FMK組。
表5
WEL對BEAS-2B細胞AMPK/NLRP3/Caspase-1通路相關蛋白表達的影響（n=6，x±s）
3 討論
炎癥反應是肺損傷的主要標志，而TNF-α、IL-1β、IL-8等炎癥因子在細胞的炎癥反應中發揮重要作用。LPS作為感染疾病中的主要促炎因子之一，過量時會促進TNF-α、IL-1β、IL-8等相關炎癥細胞因子大量分泌和釋放，導致肺血管內皮細胞和肺泡上皮細胞過度炎癥損傷，甚至細胞焦亡，從而造成肺功能損傷[8]。WEL具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，在肺損傷的治療中發揮重要作用[9]。研究發現WEL可通過調控鐵死亡抑制TNF-α、IL-1β水平，從而減輕高氧性急性肺損傷[10]。WEL可以抑制炎癥小體活化，減輕急性胰腺炎和相關肺損傷[11]。本研究顯示WEL可以減輕LPS誘導的肺泡上皮細胞炎癥，降低TNF-α、IL-1β、IL-8水平，抑制細胞死亡。
細胞焦亡是細胞死亡的一種，適當的焦亡可以使宿主對感染病起到防御作用，過度焦亡可以危害宿主。細胞焦亡是一種炎性半胱氨酸蛋白酶依賴性的細胞程序性死亡，與多種炎癥性疾病相關。當細胞受到傷害刺激，形成含NLR的炎癥小體，其中NLRP3最具有代表性，然后與凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）結合，形成炎癥小體復合物，激活多種Caspase如Caspase-1，從而造成多種GSDMD蛋白家族成員發生剪切和多聚化，釋放大量促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-8等，造成細胞穿孔死亡，最終焦亡[12-13]。研究顯示Caspase-1、NLRP3、GSDMD焦亡相關因子的缺失可以減輕炎癥反應，降低胰腺炎引起的焦亡[14]。電針可抑制NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、GSDMD-N蛋白表達及IL-1β、IL-8水平，減輕大鼠膿毒癥急性肺損傷[15]。本研究顯示WEL可以抑制Caspase-1、GSDMD水平，從而減輕細胞焦亡。
AMPK/NLRP3/Caspase-1信號通路作為經典細胞焦亡通路，在細胞炎癥反應及焦亡過程中發揮重要作用。當機體遭到損傷時，可激活NLRs和Caspase-1，促進下游相關因子的表達，進而增加炎癥因子的釋放，加劇炎癥反應，促進細胞的焦亡。而降低NLRP3、Caspase-1水平和炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8釋放，可以抑制細胞焦亡，減輕炎癥，從而起到保護作用[16]。AMPK作為真核細胞的能量感受器，能夠協調包括自噬、凋亡、細胞周期和蛋白質合成在內的一系列細胞過程，與人類疾病的發生發展密切相關，其可以抑制NLRP3介導的細胞焦亡，從而保護肺損傷[17]。本研究顯示WEL可以上調AMPK，下調NLRP3、Caspase-1表達，AMPK抑制劑可以逆轉AMPK對LPS誘導的肺上皮細胞焦亡的抑制作用，WEL與Caspase-1抑制劑均可以降低細胞的炎癥水平，抑制細胞焦亡。說明WEL通過增加AMPK磷酸化，可抑制NLRP3，可抑制Caspase-1表達，從而抑制細胞焦亡。
綜上所述，WEL可以通過抑制AMPK/NLRP3/Caspase-1信號通路，從而抑制LPS誘導的肺泡上皮細胞焦亡。但是WEL調控AMPK/NLRP3/Caspase-1信號通路的作用機制仍需結合動物模型進一步研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
急性肺損傷是由多種致病因素導致的炎癥綜合征，主要表現為肺上皮細胞損傷，嚴重時可以引起細胞焦亡[1]。脂多糖（lipolyaccharide，LPS）作為革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分，可以引起急性肺損傷，常被用于構建肺損傷模型[2]。蟛蜞菊內酯（wedelactone，WEL）是菊科植物墨旱蓮的主要成分之一，具有抗炎、抗氧化等作用。研究顯示，WEL可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate activates protein kinase，AMPK）增加AMPK磷酸化水平，減少肺部炎癥細胞浸潤，減輕肺纖維化[3]。AMPK/核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（nucleotide-bound oligomerized domain-like receptor 3，NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）信號通路是細胞焦亡經典通路。研究顯示達格列凈可激活AMPK，抑制NLRP3、Caspase-1活化，發揮抗炎、抗氧化、抗焦亡作用，改善急性肺損傷[4]。但是WEL是否可以通過AMPK/NLRP3/Caspase-1信號通路，減輕LPS誘導的肺泡上皮細胞焦亡還有待進一步研究。本研究探索WEL對LPS誘導的肺泡上皮細胞焦亡及AMPK/NLRP3/Caspase-1信號通路的影響，為肺損傷的治療提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要材料
BEAS-2B細胞（Y-00805）購于上海酶研生物科技有限公司。LPS（L8880）購于上海恒斐生物科技有限公司。WEL（HPLC≥98%）購于上海吉至生化科技有限公司。AMPK抑制劑Compound C（HY-13418A）購于MCE公司。Caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK（HY-P1009）購于美國MedChemExpress公司。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）（PT518）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）（PI640）酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；熒光標記的山羊抗兔lgG（ab150077）購于上海abcam公司；Gasdermin家族蛋白（gasdermin family proteins，DGSDMD）（sc-393581）購于Santa Cruz Biotechnology公司；AMPK（ab32047）、NLRP3（ab263899）、Caspase-1（ab62698）單抗購于上海Abcam公司；GAPDH單抗（5174）購于美國Cell Signaling Technology公司。
1.2 方法
1.2.1 MTT法檢測細胞活性
在37℃、5% CO2培養箱中用含10%磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）的DMEM培養基培養BEAS-2B細胞，至細胞生長到對數期，用不同濃度的WEL處理BEAS-2B細胞，并將細胞置于37℃ 5% CO2培養箱培養2天，離心去上清，加入20 μL 5 g/L MTT溶液，37℃恒溫培養箱培養4 h，離心去上清，加入100 μL DMSO，渦旋振蕩，酶標儀測OD值。
1.2.2 細胞分組及處理
將肺泡上皮細胞BEAS-2B分為對照組、脂多糖組（LPS組）、10 μmol/L蟛蜞菊內酯組（WEL-L組）、20 μmol/L蟛蜞菊內酯組（WEL-M組）、40 μmol/L蟛蜞菊內酯組（WEL-H組）、40 μmol/L蟛蜞菊內酯+10 μmol/L AMPK抑制劑Compound C組（WEL-H+Compound C組）、20 μmol/L Caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK組（Z-YVAD-FMK組）。對照組細胞不做任何處理；LPS組細胞用濃度為10 μg/mL LPS處理24 h[5]；WEL-L組、WEL-M組和WEL-H組細胞用濃度為10 μg/mL LPS及分別用10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L的WEL共培養處理24 h；WEL-H+Compound C組細胞用10 μg/mL LPS、40 μmol/L的WEL、10 μmol/L AMPK抑制劑Compound C[6]共培養處理24 h；Z-YVAD-FMK組細胞用10 μg/mL LPS、20 μmol/L Caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK[7]共培養處理24 h。
1.2.3 ELISA檢測炎癥因子
收集1.2.2制備的各組細胞培養基上清液，ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、IL-8水平。
1.2.4 細胞顯微結構觀察細胞超微結構
取1.2.2制備的各組細胞用胰酶消化后將細胞懸液移入離心管，離心棄上清，加入1 mL 2.5%戊二醛溶液固定細胞，制作電鏡切片，用透射電鏡觀察各組細胞超微結構。
1.2.5 免疫熒光檢測Caspase-1、DGSDMD蛋白表達
取含1.2.2各組細胞玻片放置在24孔板，每孔2×105個細胞，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.5% Triton X-100 4℃透膜5 min，含5% BSA的PBS室溫封閉1 h，分別加入一抗Caspase-1、GSDMD 4℃孵育過夜，再加入二抗山羊抗兔lgG（H+L）37℃孵育1 h。PI染核5 min，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，Image J軟件分析蛋白熒光強度。
1.2.6 Western blot法檢測AMPK、NLRP3、Caspase-1表達
取1.2.2制備的各組細胞加入RIPA細胞裂解液裂解蛋白，電泳分離，轉膜封閉。隨后加入一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育，ECL曝光，Image J軟件分析條帶灰度值。
1.3 統計學方法
采用SPSS 25.0進行統計分析，呈正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 WEL對BEAS-2B細胞活性的影響
與對照組相比，100 μmol/L及200 μmol/L的WEL處理后細胞活性顯著下降（P<0.05），而40 μmol/L及以下濃度的WEL對細胞活性無明顯影響（P>0.05），結果見表1。因此，選擇10、20、40 μmol/L的WEL不影響細胞活性的濃度進行后續實驗。
表1
WEL對BEAS-2B細胞活性的影響（n=6，x±s）
2.2 WEL對LPS誘導的BEAS-2B細胞活性的影響
隨著時間推移，除對照組，其余各組細胞存活率逐漸降低；與對照組相比，LPS組BEAS-2B細胞存活率顯著降低（P<0.05）；與LPS組相比，WEL-L組、WEL-M組、WEL-H組BEAS-2B細胞存活率依次顯著升高，Z-YVAD-FMK組細胞存活率顯著升高（P<0.05）；與WEL-H組相比，WEL-H+Compound C組細胞存活率顯著降低（P<0.05）。結果見圖1、表2。
圖1
各組細胞存活率比較
表2
WEL對LPS誘導的BEAS-2B細胞活性的影響（n=6，x±s）
2.3 WEL對LPS誘導的BEAS-2B細胞顯微結構的影響
對照組細胞內質網和線粒體形態飽滿；與對照組相比，LPS組細胞損傷嚴重，線粒體嵴斷裂且數量減少；與LPS組相比，WEL-L組、WEL-M組、WEL-H組細胞損傷依次減輕，內質網和線粒體嵴逐漸正常完整，Z-YVAD-FMK組細胞損傷不明顯，內質網與線粒體完整正常；與WEL-H組相比，WEL-H+Compound C組細胞損傷嚴重，線粒體嵴斷裂且數量減少。結果見圖2。
圖2
各組細胞透射電鏡像（×50 000）
a. 對照組；b. LPS組；c. WEL-L組；d. WEL-M組；e. WEL-H組；f. WEL-H+Compound C組；g. Z-YVAD-FMK組。
2.4 WEL對LPS誘導的BEAS-2B細胞TNF-α、IL-1β、IL-8水平的影響
與對照組相比，LPS組TNF-α、IL-1β、IL-8水平顯著上升（P<0.05）；與LPS組相比，WEL-L組、WEL-M組、WEL-H組TNF-α、IL-1β、IL-8水平依次顯著下降，Z-YVAD-FMK組TNF-α、IL-1β、IL-8水平顯著下降（P<0.05）；與WEL-H組相比，WEL-H+Compound C組TNF-α、IL-1β、IL-8水平顯著上升（P<0.05）。結果見表3。
表3
WEL對BEAS-2B細胞TNF-α、IL-1β、IL-8水平的影響（n=6，x±s）
2.5 WEL對LPS誘導的BEAS-2B細胞焦亡相關基因Caspase-1、GSDMD的影響
如圖3所示，Caspase-1、GSDMD染色呈紅色，DAPI染色呈藍色。與對照組相比，LPS組Caspase-1、GSDMD水平上升（P<0.05）；與LPS組相比，WEL-L組、WEL-M組、WEL-H組Caspase-1、GSDMD水平依次顯著下降，Z-YVAD-FMK組Caspase-1、GSDMD水平顯著下降（P<0.05）；與WEL-H組相比，WEL-H+Compound C組Caspase-1、GSDMD水平顯著上升（P<0.05）。結果見表4。
圖3
免疫熒光觀察各組細胞Caspase-1、GSDMD蛋白表達（×1 000）
表4
WEL對BEAS-2B細胞Caspase-1、GSDMD水平的影響（n=6，x±s）
2.6 WEL對AMPK/NLRP3/Caspase-1信號通路的影響
與對照組相比，LPS組p-AMPK/AMPK下降，NLRP3、Caspase-1蛋白表達上升（P<0.05）；與LPS組相比，WEL-L組、WEL-M組、WEL-H組p-AMPK/AMPK上升，NLRP3、Caspase-1蛋白表達依次下降，Z-YVAD-FMK組p-AMPK/AMPK表達上升，NLRP3、Caspase-1蛋白表達下降（P<0.05）；與WEL-H組相比，WEL-H+Compound C組p-AMPK/AMPK下降，NLRP3、Caspase-1蛋白表達上升（P<0.05）。結果見圖4和表5。
圖4
Western blot檢測AMPK/NLRP3/Caspase-1通路相關蛋白表達
a. 對照組；b. LPS組；c. WEL-L組；d. WEL-M組；e. WEL-H組；f. WEL-H+Compound C組；g. Z-YVAD-FMK組。
表5
WEL對BEAS-2B細胞AMPK/NLRP3/Caspase-1通路相關蛋白表達的影響（n=6，x±s）
3 討論
炎癥反應是肺損傷的主要標志，而TNF-α、IL-1β、IL-8等炎癥因子在細胞的炎癥反應中發揮重要作用。LPS作為感染疾病中的主要促炎因子之一，過量時會促進TNF-α、IL-1β、IL-8等相關炎癥細胞因子大量分泌和釋放，導致肺血管內皮細胞和肺泡上皮細胞過度炎癥損傷，甚至細胞焦亡，從而造成肺功能損傷[8]。WEL具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，在肺損傷的治療中發揮重要作用[9]。研究發現WEL可通過調控鐵死亡抑制TNF-α、IL-1β水平，從而減輕高氧性急性肺損傷[10]。WEL可以抑制炎癥小體活化，減輕急性胰腺炎和相關肺損傷[11]。本研究顯示WEL可以減輕LPS誘導的肺泡上皮細胞炎癥，降低TNF-α、IL-1β、IL-8水平，抑制細胞死亡。
細胞焦亡是細胞死亡的一種，適當的焦亡可以使宿主對感染病起到防御作用，過度焦亡可以危害宿主。細胞焦亡是一種炎性半胱氨酸蛋白酶依賴性的細胞程序性死亡，與多種炎癥性疾病相關。當細胞受到傷害刺激，形成含NLR的炎癥小體，其中NLRP3最具有代表性，然后與凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）結合，形成炎癥小體復合物，激活多種Caspase如Caspase-1，從而造成多種GSDMD蛋白家族成員發生剪切和多聚化，釋放大量促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-8等，造成細胞穿孔死亡，最終焦亡[12-13]。研究顯示Caspase-1、NLRP3、GSDMD焦亡相關因子的缺失可以減輕炎癥反應，降低胰腺炎引起的焦亡[14]。電針可抑制NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、GSDMD-N蛋白表達及IL-1β、IL-8水平，減輕大鼠膿毒癥急性肺損傷[15]。本研究顯示WEL可以抑制Caspase-1、GSDMD水平，從而減輕細胞焦亡。
AMPK/NLRP3/Caspase-1信號通路作為經典細胞焦亡通路，在細胞炎癥反應及焦亡過程中發揮重要作用。當機體遭到損傷時，可激活NLRs和Caspase-1，促進下游相關因子的表達，進而增加炎癥因子的釋放，加劇炎癥反應，促進細胞的焦亡。而降低NLRP3、Caspase-1水平和炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8釋放，可以抑制細胞焦亡，減輕炎癥，從而起到保護作用[16]。AMPK作為真核細胞的能量感受器，能夠協調包括自噬、凋亡、細胞周期和蛋白質合成在內的一系列細胞過程，與人類疾病的發生發展密切相關，其可以抑制NLRP3介導的細胞焦亡，從而保護肺損傷[17]。本研究顯示WEL可以上調AMPK，下調NLRP3、Caspase-1表達，AMPK抑制劑可以逆轉AMPK對LPS誘導的肺上皮細胞焦亡的抑制作用，WEL與Caspase-1抑制劑均可以降低細胞的炎癥水平，抑制細胞焦亡。說明WEL通過增加AMPK磷酸化，可抑制NLRP3，可抑制Caspase-1表達，從而抑制細胞焦亡。
綜上所述，WEL可以通過抑制AMPK/NLRP3/Caspase-1信號通路，從而抑制LPS誘導的肺泡上皮細胞焦亡。但是WEL調控AMPK/NLRP3/Caspase-1信號通路的作用機制仍需結合動物模型進一步研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
