引用本文： 潘天宇, 鄧圣潔, 林婷婷, 萬慧敏, 單夢田, 陸晶晶. 骨髓間充質干細胞通過前列腺素E2調控NLRP3抑制肺泡巨噬細胞相關炎癥反應. 中國呼吸與危重監護雜志, 2024, 23(7): 495-503. doi: 10.7507/1671-6205.202403037 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國呼吸與危重監護雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）發病機制復雜，病死率和致殘率高，其主要的機制是病原體刺激中性粒細胞或者巨噬細胞引起“炎癥因子風暴”，使肺泡-毛細血管屏障的破壞、肺水腫而導致的氣體交換障礙等[1]。大量研究表明肺部炎癥反應的失平衡是ALI/ARDS發病的關鍵環節，因此抑制和減輕肺部炎癥反應是目前ALI/ARDS治療的研究熱點。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（nucleotide-bound oligomerized domain-like receptor 3，NLRP3）炎癥小體是新的模式識別受體，其活化既可促進多種促炎癥細胞因子的成熟和分泌，還可以調節細胞焦亡，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的ALI/ARDS發生發展中起著重要作用。近年來，骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）在抗炎癥、免疫調節及促進血管新生等方面均展現出良好的臨床應用前景，研究表明BMSC在炎癥刺激下可以大量合成并釋放前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）減輕炎癥反應[2-4]。本研究旨在探究BMSC對ALI中巨噬細胞的作用，機制是否與調控PGE2與NLRP3炎癥小體的活化有關等，以期為開發新的ALI治療策略提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗動物：選擇10只SPF級（6周齡，18～22 g）健康成年雄性BALB/c小鼠。購自常州卡文斯，飼養在同濟大學附屬東方醫院動物房內，環境溫度24～26℃，環境濕度55%～60%，光/暗周期為12 h/12 h，小鼠自由飲水和進食。
實驗材料：LPS（Sigma），10%水合氯醛（上海生工），DMEM高糖/低糖培養基（Hyclone），FBS（Hyclone），DIL-ac-LDL（上海生工），Trizol（Invitrogen），DEPC處理水（CTCC），氯仿/異丙醇/無水乙醇（上海國藥），SYBRGreen PCR試劑盒（Thermo F-415XL），逆轉錄試劑盒（Thermo K1622），CD90抗體（Invitrogen 61-0902-80），CD29抗體 （Invitrogen 12-0291-81），CD45抗體（Invitrogen 67-0451-82），CD34抗體（Invitrogen 11-0341-81），BCA蛋白定量試劑盒（凱基KGPBCA），RIPA強效裂解液（碧云天P0013B），丙烯酰胺/電泳緩沖液/過硫酸銨（上海國藥），蛋白預染Marker（Thermo 26616），NLRP3（ABclonal A5652），pro-Caspase-1（ABclonal A0964），Caspase-1（ABclonal A0964），pro-IL-1β（CST 12242S），GAPDH（proteintech 60004-1-Ig），辣根酶標記山羊抗兔IgG（中杉金橋 ZB2301），辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（中杉金橋 ZB2305），腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（Elabscience E-EL-M0049c），白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）（Elabscience E-EL-M0037c），IL-10（Elabscience E-EL-M0046c），IL-18（Elabscience E-EL-M0730c），PGE2（酶聯生物）。
實驗儀器：細胞培養箱（Thermo Scientific 8000），熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS，IX71），光學顯微鏡（XDS-1A），離心機（Eppendorf），流式細胞儀（BD-FACSVerse），低溫冷凍離心機 （Sigma 3K15）， Real-time檢測儀（ABI-7500），電泳儀（BIORAD），酶標儀（ThermoMK3）等。
1.2 方法
1.2.1 支氣管肺泡灌洗獲取巨噬細胞并檢測純度
取健康SPF級成年雄性BALB/c小鼠，麻醉后暴露氣管并氣管插管，用預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）進行雙肺灌洗，回收獲得支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。BALF離心重懸后獲得肺泡巨噬細胞，在巨噬細胞培養液中加入DIL-ac-LDL，避光孵育并拍照。
1.2.2 分離及流式細胞術鑒定BMSC
用頸椎脫位法處死小鼠后，用手術剪打開骨髓腔，沖洗、離心、重懸并培養出BMSC。將分離的BMSC收集培養，每孔分別加入200 μL的染色緩沖液，以及CD90、CD29、CD45和CD34抗體。避光孵育30 min后洗滌重懸。流式細胞術定量檢測并分析。
1.2.3 建立穩定的慢病毒轉染BMSC細胞株
（1）觀察慢病毒MOI：商業合成ptges（Gene ID：64292）合成3條干擾慢病毒，1條過表達慢病毒。將病毒按照MOI為10、50、100感染BMSC，48 h后熒光顯微鏡下觀察病毒感染效率。（2）篩選出最佳敲降慢病毒：細胞內總RNA的抽提采用Trizol提取試劑盒（Invitrogen），采用第一鏈cDNA合成試劑盒（天根），SYBRGreen PCR試劑盒（Thermo F-415XL）以及逆轉錄試劑盒（Thermo K1622）等完成實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）。逆轉錄PCR所使用的引物由上海生工公司Primer Premier 5.0軟件設計、合成。根據RT-PCR反應體系配制反應液。在PCR反應管（20 μL）中分別加入ddH2O 7 μL、SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、Forward primer 1 μL、Reverse primer 1 μL、cDNA模板1 μL，充分混勻。94℃ 10 min，以及94℃ 20 s，55℃ 20s，72℃ 20 s共40個循環。PCR擴增后，以管家基因GAPDH為內參，采用2–△△CT法分析目的基因在對照組和各實驗組之間的表達差異。篩選出最佳效率的敲降慢病毒序列。（3）采用慢病毒轉染ptges及ptges shRNA至BMSC，建立穩定的ptges過表達BMSC細胞株［BMSC-PGE2（+）］及ptges沉默的BMSC細胞株［BMSC-PGE2（–）］。調整細胞數為1×106/mL接種于6孔板培養中，吸取上清，PBS沖洗3次，加入含有慢病毒的無血清培養基3 mL后繼續培養、傳代并繼續下一步實驗。
1.2.4 Western blot檢測巨噬細胞中的NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表達水平
（1）樣品準備：肺泡巨噬細胞以2×106/mL接種在Transwell上室中，隨機分為5組，即對照組、LPS組、LPS+BMSC組、LPS+BMSC-PGE2（+）組、LPS+BMSC-PGE2（–）組。共培養的3組中將BMSC/BMSC-PGE2（+）/BMSC-PGE2（–）以1×106/mL接種在Transwell下室。根據分組將肺泡巨噬細胞與BMSC/BMSC-PGE2（+）/BMSC-PGE2（–）置入Transwell共培養體系，LPS組及共培養體系組予以終濃度為10 ng/mL LPS的無血清培養基共培養5 h，然后以終濃度為5 mmol/L的ATP的無血清培養基共培養1 h。（2）收集細胞，向細胞樣本中加入預冷的已加PMSF的RIPA裂解液，混勻，冰上充分裂解離心后收集蛋白。（3）進行SDS-PAGE凝膠電泳。上樣，電泳，切膠，“三明治”法轉膜，漂洗并封閉。加入NLRP3（1∶1 000）、pro-Caspase-1（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、pro-IL-1β（1∶1 000）及GAPDH（1∶5 000）抗體，4℃孵育，漂洗后加入兔二抗或鼠二抗（1∶5 000）。加入ECL發光液顯色拍照。
1.2.5 RT-PCR檢測巨噬細胞中的NLRP3、Caspase-1的mRNA表達水平
收集各組細胞，加入Trizol試劑，提取細胞中的總RNA。隨后按照第一鏈cDNA合成試劑盒（天根）說明書合成cDNA，按照SYBRGreen PCR試劑盒（Thermo F-415XL）說明書配制RT-PCR反應體系，反應程序為：94℃ 10 min，以及94℃ 20s，55℃ 20 s，72℃ 20 s共40個循環。以管家基因GAPDH為內參，采用2–△△CT法計算NLRP3、Caspase-1的mRNA表達水平。
1.2.6 ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-18及PGE2水平
采用TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-18及PGE2 ELISA試劑盒說明書。
1.3 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件分析，呈正態分布的計量數據以均數±標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，方差不齊時采用非參數檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 成功獲取并培養肺泡巨噬細胞
采用原位支氣管肺泡灌洗法收集的BALF中90%的是肺泡巨噬細胞，紅細胞、中性粒細胞及淋巴細胞等經純化培養被去除。獲得的肺泡巨噬細胞呈圓形，偽足不明顯，貼壁后，肺泡巨噬細胞鋪展開，逐漸伸出偽足（圖1a）。熒光顯微鏡下觀察肺泡巨噬細胞內有大量DIL-ac-LDL，提示巨噬細胞吞噬活性良好（圖1b）。
圖1
小鼠巨噬細胞特征
a. 鏡下特征（×100，×200）；b. 熒光顯微鏡下細胞特征（×500）。
2.2 成功提取、培養及鑒定BMSC
BMSC原代細胞在接種24 h后逐漸貼壁，細胞胞體小，大多為梭形，核居中，偶有寬大扁平的多邊形，細胞折光性強。通過多次換液傳代，可使BMSC更為均一，成梭形成纖維樣（圖2a）。利用流式細胞儀對第3代BMSC進行鑒定，其結果顯示細胞CD29、CD90抗體陽性表達率均為99%，CD45、CD34抗體陽性表達率分別為1.39%和3.15%，提示CD29、CD90為陽性表達，CD45、CD34為陰性表達（圖2b）。符合公認的BMSC免疫表型，提示提取BMSC培養并鑒定成功。
圖2
小鼠骨髓間充質細胞特征
a. 小鼠BMSC的鏡下特征（×200）；b. 流式細胞儀鑒定結果：CD29陽性，CD90陽性，CD45陰性、CD34陰性。
2.3 確定慢病毒MOI值及感染效率最佳的序列
熒光顯微鏡下觀察可見，沉默慢病毒當MOI值為50時，感染效率已達80%以上，故后續選擇MOI值為50進行實驗（圖3a），而過表達慢病毒選擇MOI為100進行后續實驗（圖3b）。RT-PCR實驗結果顯示，相比對照組，當分別感染沉默慢病毒后，目的基因表達水平均有不同程度的降低，其中慢病毒2效果最好（圖3c），所以后期選擇該靶向序列用于實驗。
圖3
BMSC細胞株轉染慢病毒熒光顯微鏡下像和RT-PCR結果
a. 沉默慢病毒的鏡下特征（×50）；b. 過表達慢病毒的鏡下特征（×50）；c. RT-PCR顯示shRNA2沉默效率最高。與對照組比較，**
2.4 巨噬細胞中的NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1、pro-IL-1β蛋白表達水平變化
Western blot結果顯示，LPS組NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表達量較對照組明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）；LPS+BMSC組巨噬細胞與BMSC共培養后，NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表達較LPS組明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）；LPS+BMSC-PGE2（+）組中巨噬細胞與BMSC-PGE2（+）共培養后，NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表達進一步下降，差異有統計學意義（P<0.01）；而LPS+BMSC-PGE2（–）組與LPS組無明顯變化，差異無統計學意義（圖4）。表明LPS刺激后的巨噬細胞中，BMSC通過分泌PGE2，進一步抑制下游NLRP3炎癥小體的活化，減輕炎癥反應。
圖4
NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1、pro-IL-1β蛋白表達Western blot結果
a. NLRP3的表達水平；b. Caspase-1的表達水平；c. pro-Caspase-1的表達水平；d. pro-IL-1β的表達水平；e. NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表達水平的代表性圖像。與對照組比較，**
2.5 巨噬細胞中的NLRP3、Caspase-1的mRNA表達水平變化
RT-PCR實驗結果顯示，LPS組NLRP3、Caspase-1的mRNA表達量較對照組明顯升高，差異顯著，具有統計學意義（P<0.01）；LPS+BMSC組巨噬細胞與BMSC共培養后，NLRP3、Caspase-1的mRNA表達量較LPS組明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）；LPS+BMSC-PGE2（+）組中，巨噬細胞與BMSC-PGE2（+）共培養后，NLRP3、Caspase-1的mRNA表達量進一步下降，差異有統計學意義（P<0.01）；而LPS+BMSC-PGE2（–）組與LPS組無明顯變化，差異無統計學意義（圖5）。
圖5
各組NLRP3的表達水平（a）以及Caspase-1的表達水平（b）
與對照組比較，**
2.6 細胞上清液中相關炎癥因子的水平變化
ELISA結果顯示，培養液上清中TNF-α、IL-1β及IL-18含量在LPS組中最高，顯著高于對照組、LPS+BMSC組和LPS+BMSC-PGE2（+）組，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。培養液上清中IL-10和PGE2含量，LPS組較對照組有升高趨勢，LPS+BMSC組和LPS+BMSC-PGE2（+）組進一步增加，與LPS組比較差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），LPS+BMSC-PGE2（–）組與LPS組沒有顯著差異（圖6）。
圖6
細胞上清液中相關炎癥因子表達的ELISA結果
a. TNF-α的表達水平；b. IL-1β的表達水平；c. PGE2的表達水平；d. IL-10的表達水平；e. IL-18的表達水平。與對照組比較，*
3 討論
ALI和ARDS起病急，病情非常兇險，病死率高，是嚴重威脅人類健康的呼吸系統急危重癥[5]。其本質是由多種炎性介質和效應細胞共同參與，呈瀑布樣級聯放大的炎癥反應，發病過程中涉及炎癥、凋亡、氧化應激等一系列信號通路。肺泡巨噬細胞的激活是ALI/ARDS進程中的始動環節[6]，在受到內外致病因素的刺激下，一方面分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和巨噬細胞炎性蛋白2（macrophage inflammatory protein 2，MIP-2）等促炎因子，后者募集大量中性粒細胞，啟動和維持肺部炎癥反應，造成肺泡上皮細胞和血管內皮細胞損傷；另一方面，肺泡巨噬細胞還可以分泌IL-4、IL-10等抗炎因子，后者促進免疫細胞吞噬壞死組織細胞和凋亡的中性粒細胞，促進炎癥消散和組織修復。因此，肺泡巨噬細胞介導的促炎和抗炎失衡是ALI/ARDS發生發展的關鍵性因素。
近年來許多研究證實了BMSC可調節肺部炎癥反應，恢復細胞因子網絡之間的平衡，減少促炎因子的分泌，增加抗炎標志物和細胞因子的釋放[7]。在我們的研究中，通過流式細胞儀得到CD29、CD90為陽性表達，而CD45、CD34為陰性表達的較為純化的BMSC，可以用于進一步實驗。在LPS誘導的ALI模型中，肺泡巨噬細胞相關炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18的表達明顯增加，而BMSC能夠明顯逆轉這些促炎因子的表達并增強抗炎因子IL-10 的表達水平。同時，與BMSC相比，過表達PGE2的BMSC可進一步抑制炎癥反應，表明過表達PGE2可增強BMSC對LPS誘導的肺泡巨噬細胞損傷的保護作用。
NLRP3是一種模式識別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）[8]，主要在中性粒細胞和巨噬細胞的細胞質中表達，其組成部分包括先天免疫受體蛋白NLRP3、炎性蛋白酶Caspase-1與銜接蛋白ASC。作為機體固有免疫的重要組成部分[9-10]，NLRP3蛋白可被病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）識別并激活，如NLRP3炎癥小體可以被細菌LPS、活性氧、K+外流、Ca2+信號、毒素、顆粒物質、病毒RNA和溶酶體破壞等。NLRP3炎癥小體激活機制有三種不同信號通路：經典NLRP3炎性體激活、非經典NLRP3炎性體激活和替代NLRP3 炎性體激活（也稱為一步NLRP3 炎性體激活）[11-12]。NLRP3炎性體的激活將誘導pro-Caspase-1的自我切割和激活，從而促進包括IL-1β和IL-18在內的多種促炎性細胞因子的剪切和分泌[13]，另一方面活化的Caspase-1還將切割消皮素D（gasdermin D，GSDMD）并釋放其N端結構域，這一結構域將轉移并在細胞膜處形成孔，從而釋放細胞內容物，進而調節程序性細胞焦亡（pyroptosis），誘導細胞在炎性和應激的病理條件下死亡[3，14-17]。研究表明在小鼠ALI模型中，NLRP3炎癥小體可被激活，而抑制NLRP3炎癥小體可以顯著抑制TNF-α、IL-1β的合成和分泌，改善膿毒癥所致的肺泡上皮細胞通透性的增加[18]。因此，NLRP3炎癥小體的活化在ALI的發生發展中起到重要作用。
其中，包括PGE2在內的許多因子都與NLRP3炎癥小體通路激活密切相關[4，19]。PGE合酶（PGE synthase，PTGES）作為PGE2合成中的終末限速酶，參與PGE2的合成[20]。PGE2通過前列腺素E受體（prostaglandin E receptor，EP）家族的4種不同受體發出信號：EP1、EP2、EP3和EP4[21]。研究發現NLRP3炎癥體的快速激活被蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）直接抑制，PKA直接磷酸化胞漿受體NLRP3，減弱其ATP酶功能。而PKA是由PGE2通過PGE2受體EP4信號傳導誘導的[1]。還有研究發現PGE2通過促進抗炎因子IL-10的分泌，能夠抑制中性粒細胞的黏附和內皮細胞激活，對NLRP3炎性小體有拮抗作用[22-23]。阻斷巨噬細胞IL-10受體可促進NLRP3炎性體的激活[24]，NLRP3炎癥小體的活化也可以抑制單核細胞中IL-10的分泌[25]。IL-10基因敲除的小鼠在LPS刺激后，NLRP3、pro-Caspase-1和pro-IL-1β水平均明顯高于野生型[26]，因此通過IL-10來抑制NLRP3炎癥小體的活化可能是PGE2的作用機制之一。本研究中，BMSC可明顯抑制NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β的表達，降低TNF-α、IL-1β表達水平，增加IL-10的表達水平，當給予過表達PGE2的BMSC后，PGE2可抑制NLRP3活化，與BMSC相比，對ALI的抑制作用進一步增強，從而發揮對ALI的治療作用。
綜上所述，研究結果從細胞層面表明，在LPS誘導的ALI發病過程中，BMSC通過攜帶并分泌PGE2來促進肺泡巨噬細胞中抗炎因子的釋放，從而抑制肺泡巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的活化，減輕肺部炎性損害。本研究為運用BMSC來調控ALI時的炎癥反應提供理論基礎，為臨床救治ALI患者提供新的治療策略和重要的理論依據。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）發病機制復雜，病死率和致殘率高，其主要的機制是病原體刺激中性粒細胞或者巨噬細胞引起“炎癥因子風暴”，使肺泡-毛細血管屏障的破壞、肺水腫而導致的氣體交換障礙等[1]。大量研究表明肺部炎癥反應的失平衡是ALI/ARDS發病的關鍵環節，因此抑制和減輕肺部炎癥反應是目前ALI/ARDS治療的研究熱點。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3（nucleotide-bound oligomerized domain-like receptor 3，NLRP3）炎癥小體是新的模式識別受體，其活化既可促進多種促炎癥細胞因子的成熟和分泌，還可以調節細胞焦亡，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的ALI/ARDS發生發展中起著重要作用。近年來，骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）在抗炎癥、免疫調節及促進血管新生等方面均展現出良好的臨床應用前景，研究表明BMSC在炎癥刺激下可以大量合成并釋放前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）減輕炎癥反應[2-4]。本研究旨在探究BMSC對ALI中巨噬細胞的作用，機制是否與調控PGE2與NLRP3炎癥小體的活化有關等，以期為開發新的ALI治療策略提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗動物：選擇10只SPF級（6周齡，18～22 g）健康成年雄性BALB/c小鼠。購自常州卡文斯，飼養在同濟大學附屬東方醫院動物房內，環境溫度24～26℃，環境濕度55%～60%，光/暗周期為12 h/12 h，小鼠自由飲水和進食。
實驗材料：LPS（Sigma），10%水合氯醛（上海生工），DMEM高糖/低糖培養基（Hyclone），FBS（Hyclone），DIL-ac-LDL（上海生工），Trizol（Invitrogen），DEPC處理水（CTCC），氯仿/異丙醇/無水乙醇（上海國藥），SYBRGreen PCR試劑盒（Thermo F-415XL），逆轉錄試劑盒（Thermo K1622），CD90抗體（Invitrogen 61-0902-80），CD29抗體 （Invitrogen 12-0291-81），CD45抗體（Invitrogen 67-0451-82），CD34抗體（Invitrogen 11-0341-81），BCA蛋白定量試劑盒（凱基KGPBCA），RIPA強效裂解液（碧云天P0013B），丙烯酰胺/電泳緩沖液/過硫酸銨（上海國藥），蛋白預染Marker（Thermo 26616），NLRP3（ABclonal A5652），pro-Caspase-1（ABclonal A0964），Caspase-1（ABclonal A0964），pro-IL-1β（CST 12242S），GAPDH（proteintech 60004-1-Ig），辣根酶標記山羊抗兔IgG（中杉金橋 ZB2301），辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（中杉金橋 ZB2305），腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（Elabscience E-EL-M0049c），白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）（Elabscience E-EL-M0037c），IL-10（Elabscience E-EL-M0046c），IL-18（Elabscience E-EL-M0730c），PGE2（酶聯生物）。
實驗儀器：細胞培養箱（Thermo Scientific 8000），熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS，IX71），光學顯微鏡（XDS-1A），離心機（Eppendorf），流式細胞儀（BD-FACSVerse），低溫冷凍離心機 （Sigma 3K15）， Real-time檢測儀（ABI-7500），電泳儀（BIORAD），酶標儀（ThermoMK3）等。
1.2 方法
1.2.1 支氣管肺泡灌洗獲取巨噬細胞并檢測純度
取健康SPF級成年雄性BALB/c小鼠，麻醉后暴露氣管并氣管插管，用預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）進行雙肺灌洗，回收獲得支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。BALF離心重懸后獲得肺泡巨噬細胞，在巨噬細胞培養液中加入DIL-ac-LDL，避光孵育并拍照。
1.2.2 分離及流式細胞術鑒定BMSC
用頸椎脫位法處死小鼠后，用手術剪打開骨髓腔，沖洗、離心、重懸并培養出BMSC。將分離的BMSC收集培養，每孔分別加入200 μL的染色緩沖液，以及CD90、CD29、CD45和CD34抗體。避光孵育30 min后洗滌重懸。流式細胞術定量檢測并分析。
1.2.3 建立穩定的慢病毒轉染BMSC細胞株
（1）觀察慢病毒MOI：商業合成ptges（Gene ID：64292）合成3條干擾慢病毒，1條過表達慢病毒。將病毒按照MOI為10、50、100感染BMSC，48 h后熒光顯微鏡下觀察病毒感染效率。（2）篩選出最佳敲降慢病毒：細胞內總RNA的抽提采用Trizol提取試劑盒（Invitrogen），采用第一鏈cDNA合成試劑盒（天根），SYBRGreen PCR試劑盒（Thermo F-415XL）以及逆轉錄試劑盒（Thermo K1622）等完成實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）。逆轉錄PCR所使用的引物由上海生工公司Primer Premier 5.0軟件設計、合成。根據RT-PCR反應體系配制反應液。在PCR反應管（20 μL）中分別加入ddH2O 7 μL、SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、Forward primer 1 μL、Reverse primer 1 μL、cDNA模板1 μL，充分混勻。94℃ 10 min，以及94℃ 20 s，55℃ 20s，72℃ 20 s共40個循環。PCR擴增后，以管家基因GAPDH為內參，采用2–△△CT法分析目的基因在對照組和各實驗組之間的表達差異。篩選出最佳效率的敲降慢病毒序列。（3）采用慢病毒轉染ptges及ptges shRNA至BMSC，建立穩定的ptges過表達BMSC細胞株［BMSC-PGE2（+）］及ptges沉默的BMSC細胞株［BMSC-PGE2（–）］。調整細胞數為1×106/mL接種于6孔板培養中，吸取上清，PBS沖洗3次，加入含有慢病毒的無血清培養基3 mL后繼續培養、傳代并繼續下一步實驗。
1.2.4 Western blot檢測巨噬細胞中的NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表達水平
（1）樣品準備：肺泡巨噬細胞以2×106/mL接種在Transwell上室中，隨機分為5組，即對照組、LPS組、LPS+BMSC組、LPS+BMSC-PGE2（+）組、LPS+BMSC-PGE2（–）組。共培養的3組中將BMSC/BMSC-PGE2（+）/BMSC-PGE2（–）以1×106/mL接種在Transwell下室。根據分組將肺泡巨噬細胞與BMSC/BMSC-PGE2（+）/BMSC-PGE2（–）置入Transwell共培養體系，LPS組及共培養體系組予以終濃度為10 ng/mL LPS的無血清培養基共培養5 h，然后以終濃度為5 mmol/L的ATP的無血清培養基共培養1 h。（2）收集細胞，向細胞樣本中加入預冷的已加PMSF的RIPA裂解液，混勻，冰上充分裂解離心后收集蛋白。（3）進行SDS-PAGE凝膠電泳。上樣，電泳，切膠，“三明治”法轉膜，漂洗并封閉。加入NLRP3（1∶1 000）、pro-Caspase-1（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、pro-IL-1β（1∶1 000）及GAPDH（1∶5 000）抗體，4℃孵育，漂洗后加入兔二抗或鼠二抗（1∶5 000）。加入ECL發光液顯色拍照。
1.2.5 RT-PCR檢測巨噬細胞中的NLRP3、Caspase-1的mRNA表達水平
收集各組細胞，加入Trizol試劑，提取細胞中的總RNA。隨后按照第一鏈cDNA合成試劑盒（天根）說明書合成cDNA，按照SYBRGreen PCR試劑盒（Thermo F-415XL）說明書配制RT-PCR反應體系，反應程序為：94℃ 10 min，以及94℃ 20s，55℃ 20 s，72℃ 20 s共40個循環。以管家基因GAPDH為內參，采用2–△△CT法計算NLRP3、Caspase-1的mRNA表達水平。
1.2.6 ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-18及PGE2水平
采用TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-18及PGE2 ELISA試劑盒說明書。
1.3 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件分析，呈正態分布的計量數據以均數±標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，方差不齊時采用非參數檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 成功獲取并培養肺泡巨噬細胞
采用原位支氣管肺泡灌洗法收集的BALF中90%的是肺泡巨噬細胞，紅細胞、中性粒細胞及淋巴細胞等經純化培養被去除。獲得的肺泡巨噬細胞呈圓形，偽足不明顯，貼壁后，肺泡巨噬細胞鋪展開，逐漸伸出偽足（圖1a）。熒光顯微鏡下觀察肺泡巨噬細胞內有大量DIL-ac-LDL，提示巨噬細胞吞噬活性良好（圖1b）。
圖1
小鼠巨噬細胞特征
a. 鏡下特征（×100，×200）；b. 熒光顯微鏡下細胞特征（×500）。
2.2 成功提取、培養及鑒定BMSC
BMSC原代細胞在接種24 h后逐漸貼壁，細胞胞體小，大多為梭形，核居中，偶有寬大扁平的多邊形，細胞折光性強。通過多次換液傳代，可使BMSC更為均一，成梭形成纖維樣（圖2a）。利用流式細胞儀對第3代BMSC進行鑒定，其結果顯示細胞CD29、CD90抗體陽性表達率均為99%，CD45、CD34抗體陽性表達率分別為1.39%和3.15%，提示CD29、CD90為陽性表達，CD45、CD34為陰性表達（圖2b）。符合公認的BMSC免疫表型，提示提取BMSC培養并鑒定成功。
圖2
小鼠骨髓間充質細胞特征
a. 小鼠BMSC的鏡下特征（×200）；b. 流式細胞儀鑒定結果：CD29陽性，CD90陽性，CD45陰性、CD34陰性。
2.3 確定慢病毒MOI值及感染效率最佳的序列
熒光顯微鏡下觀察可見，沉默慢病毒當MOI值為50時，感染效率已達80%以上，故后續選擇MOI值為50進行實驗（圖3a），而過表達慢病毒選擇MOI為100進行后續實驗（圖3b）。RT-PCR實驗結果顯示，相比對照組，當分別感染沉默慢病毒后，目的基因表達水平均有不同程度的降低，其中慢病毒2效果最好（圖3c），所以后期選擇該靶向序列用于實驗。
圖3
BMSC細胞株轉染慢病毒熒光顯微鏡下像和RT-PCR結果
a. 沉默慢病毒的鏡下特征（×50）；b. 過表達慢病毒的鏡下特征（×50）；c. RT-PCR顯示shRNA2沉默效率最高。與對照組比較，**
2.4 巨噬細胞中的NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1、pro-IL-1β蛋白表達水平變化
Western blot結果顯示，LPS組NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表達量較對照組明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）；LPS+BMSC組巨噬細胞與BMSC共培養后，NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表達較LPS組明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）；LPS+BMSC-PGE2（+）組中巨噬細胞與BMSC-PGE2（+）共培養后，NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表達進一步下降，差異有統計學意義（P<0.01）；而LPS+BMSC-PGE2（–）組與LPS組無明顯變化，差異無統計學意義（圖4）。表明LPS刺激后的巨噬細胞中，BMSC通過分泌PGE2，進一步抑制下游NLRP3炎癥小體的活化，減輕炎癥反應。
圖4
NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1、pro-IL-1β蛋白表達Western blot結果
a. NLRP3的表達水平；b. Caspase-1的表達水平；c. pro-Caspase-1的表達水平；d. pro-IL-1β的表達水平；e. NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β蛋白表達水平的代表性圖像。與對照組比較，**
2.5 巨噬細胞中的NLRP3、Caspase-1的mRNA表達水平變化
RT-PCR實驗結果顯示，LPS組NLRP3、Caspase-1的mRNA表達量較對照組明顯升高，差異顯著，具有統計學意義（P<0.01）；LPS+BMSC組巨噬細胞與BMSC共培養后，NLRP3、Caspase-1的mRNA表達量較LPS組明顯減少，差異有統計學意義（P<0.05）；LPS+BMSC-PGE2（+）組中，巨噬細胞與BMSC-PGE2（+）共培養后，NLRP3、Caspase-1的mRNA表達量進一步下降，差異有統計學意義（P<0.01）；而LPS+BMSC-PGE2（–）組與LPS組無明顯變化，差異無統計學意義（圖5）。
圖5
各組NLRP3的表達水平（a）以及Caspase-1的表達水平（b）
與對照組比較，**
2.6 細胞上清液中相關炎癥因子的水平變化
ELISA結果顯示，培養液上清中TNF-α、IL-1β及IL-18含量在LPS組中最高，顯著高于對照組、LPS+BMSC組和LPS+BMSC-PGE2（+）組，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。培養液上清中IL-10和PGE2含量，LPS組較對照組有升高趨勢，LPS+BMSC組和LPS+BMSC-PGE2（+）組進一步增加，與LPS組比較差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），LPS+BMSC-PGE2（–）組與LPS組沒有顯著差異（圖6）。
圖6
細胞上清液中相關炎癥因子表達的ELISA結果
a. TNF-α的表達水平；b. IL-1β的表達水平；c. PGE2的表達水平；d. IL-10的表達水平；e. IL-18的表達水平。與對照組比較，*
3 討論
ALI和ARDS起病急，病情非常兇險，病死率高，是嚴重威脅人類健康的呼吸系統急危重癥[5]。其本質是由多種炎性介質和效應細胞共同參與，呈瀑布樣級聯放大的炎癥反應，發病過程中涉及炎癥、凋亡、氧化應激等一系列信號通路。肺泡巨噬細胞的激活是ALI/ARDS進程中的始動環節[6]，在受到內外致病因素的刺激下，一方面分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和巨噬細胞炎性蛋白2（macrophage inflammatory protein 2，MIP-2）等促炎因子，后者募集大量中性粒細胞，啟動和維持肺部炎癥反應，造成肺泡上皮細胞和血管內皮細胞損傷；另一方面，肺泡巨噬細胞還可以分泌IL-4、IL-10等抗炎因子，后者促進免疫細胞吞噬壞死組織細胞和凋亡的中性粒細胞，促進炎癥消散和組織修復。因此，肺泡巨噬細胞介導的促炎和抗炎失衡是ALI/ARDS發生發展的關鍵性因素。
近年來許多研究證實了BMSC可調節肺部炎癥反應，恢復細胞因子網絡之間的平衡，減少促炎因子的分泌，增加抗炎標志物和細胞因子的釋放[7]。在我們的研究中，通過流式細胞儀得到CD29、CD90為陽性表達，而CD45、CD34為陰性表達的較為純化的BMSC，可以用于進一步實驗。在LPS誘導的ALI模型中，肺泡巨噬細胞相關炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-18的表達明顯增加，而BMSC能夠明顯逆轉這些促炎因子的表達并增強抗炎因子IL-10 的表達水平。同時，與BMSC相比，過表達PGE2的BMSC可進一步抑制炎癥反應，表明過表達PGE2可增強BMSC對LPS誘導的肺泡巨噬細胞損傷的保護作用。
NLRP3是一種模式識別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）[8]，主要在中性粒細胞和巨噬細胞的細胞質中表達，其組成部分包括先天免疫受體蛋白NLRP3、炎性蛋白酶Caspase-1與銜接蛋白ASC。作為機體固有免疫的重要組成部分[9-10]，NLRP3蛋白可被病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）識別并激活，如NLRP3炎癥小體可以被細菌LPS、活性氧、K+外流、Ca2+信號、毒素、顆粒物質、病毒RNA和溶酶體破壞等。NLRP3炎癥小體激活機制有三種不同信號通路：經典NLRP3炎性體激活、非經典NLRP3炎性體激活和替代NLRP3 炎性體激活（也稱為一步NLRP3 炎性體激活）[11-12]。NLRP3炎性體的激活將誘導pro-Caspase-1的自我切割和激活，從而促進包括IL-1β和IL-18在內的多種促炎性細胞因子的剪切和分泌[13]，另一方面活化的Caspase-1還將切割消皮素D（gasdermin D，GSDMD）并釋放其N端結構域，這一結構域將轉移并在細胞膜處形成孔，從而釋放細胞內容物，進而調節程序性細胞焦亡（pyroptosis），誘導細胞在炎性和應激的病理條件下死亡[3，14-17]。研究表明在小鼠ALI模型中，NLRP3炎癥小體可被激活，而抑制NLRP3炎癥小體可以顯著抑制TNF-α、IL-1β的合成和分泌，改善膿毒癥所致的肺泡上皮細胞通透性的增加[18]。因此，NLRP3炎癥小體的活化在ALI的發生發展中起到重要作用。
其中，包括PGE2在內的許多因子都與NLRP3炎癥小體通路激活密切相關[4，19]。PGE合酶（PGE synthase，PTGES）作為PGE2合成中的終末限速酶，參與PGE2的合成[20]。PGE2通過前列腺素E受體（prostaglandin E receptor，EP）家族的4種不同受體發出信號：EP1、EP2、EP3和EP4[21]。研究發現NLRP3炎癥體的快速激活被蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）直接抑制，PKA直接磷酸化胞漿受體NLRP3，減弱其ATP酶功能。而PKA是由PGE2通過PGE2受體EP4信號傳導誘導的[1]。還有研究發現PGE2通過促進抗炎因子IL-10的分泌，能夠抑制中性粒細胞的黏附和內皮細胞激活，對NLRP3炎性小體有拮抗作用[22-23]。阻斷巨噬細胞IL-10受體可促進NLRP3炎性體的激活[24]，NLRP3炎癥小體的活化也可以抑制單核細胞中IL-10的分泌[25]。IL-10基因敲除的小鼠在LPS刺激后，NLRP3、pro-Caspase-1和pro-IL-1β水平均明顯高于野生型[26]，因此通過IL-10來抑制NLRP3炎癥小體的活化可能是PGE2的作用機制之一。本研究中，BMSC可明顯抑制NLRP3、pro-Caspase-1、Caspase-1及pro-IL-1β的表達，降低TNF-α、IL-1β表達水平，增加IL-10的表達水平，當給予過表達PGE2的BMSC后，PGE2可抑制NLRP3活化，與BMSC相比，對ALI的抑制作用進一步增強，從而發揮對ALI的治療作用。
綜上所述，研究結果從細胞層面表明，在LPS誘導的ALI發病過程中，BMSC通過攜帶并分泌PGE2來促進肺泡巨噬細胞中抗炎因子的釋放，從而抑制肺泡巨噬細胞中NLRP3炎癥小體的活化，減輕肺部炎性損害。本研究為運用BMSC來調控ALI時的炎癥反應提供理論基礎，為臨床救治ALI患者提供新的治療策略和重要的理論依據。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
