引用本文： 張艷梅, 張程. S-腺苷甲硫氨酸對戒煙肺氣腫小鼠氧化應激、肺泡隔細胞凋亡的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2024, 23(11): 797-801. doi: 10.7507/1671-6205.202403063 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國呼吸與危重監護雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種以持續的呼吸道癥狀和不可逆的氣流受限為特征的慢性呼吸道疾病，以肺氣腫和慢性支氣管炎為主要病理改變。慢阻肺患病率及病死率較高，嚴重威脅人們健康。目前，吸煙是慢阻肺公認的主要病因及誘因，但臨床發現許多患者戒煙之后氣道炎癥及肺泡損害持續存在，甚至不斷進展導致肺功能進行性惡化[1]。研究發現香煙煙霧可通過誘導炎癥反應、氧化應激和肺泡隔細胞凋亡等不同途徑參與慢阻肺或肺氣腫的發生、發展[1-2]。而氧化應激、肺泡隔細胞凋亡與戒煙后肺氣腫變化的關系以及藥物干預等，目前尚無系統研究。S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-l-methionine，SAM）是一種能改善細胞代謝的生物活性物質，可參與多種生化反應，具有抗氧化作用[3-4]。我們前期研究發現SAM可通過抗氧化機制抑制大鼠自身免疫肺氣腫的形成[5]，但SAM能否抑制戒煙后小鼠肺氣腫的進展國內外尚無文獻報導。本研究通過腹腔注射香煙煙霧提取物聯合香煙煙霧暴露建立小鼠肺氣腫模型，檢測肺泡灌洗液中丙二醛（malondialdehyde ，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）濃度和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及肺泡隔細胞凋亡、肺組織病理形態學改變等，評估SAM 的干預效果，為臨床上探討戒煙后肺氣腫持續進展的發病機制及尋求新的治療方法提供線索。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗材料與試劑：自制有機玻璃煙熏艙1個（規格55 cm×43 cm×40 cm）；黃果樹牌香煙，每支煙草含焦油量12 mg，煙堿含量1.1 mg；芙蓉牌香煙，每支煙草含焦油13 mg，尼古丁1.0 mg，一氧化碳14 mg。MDA試劑盒、SOD試劑盒、GSH測試盒購于南京建成生物工程研究所。蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）染色液（北京索萊寶生物技術有限公司）。SAM為注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸（意大利AB-BOTTS.R.L）。
實驗動物及分組：SPF級C57BL/6J小鼠［購自重慶市騰鑫科技公司，許可證號SCXK（京）2019-0010］32只，雄性，6～8周齡，體重18～20 g，飼養于貴州中醫藥大學實驗動物研究所。實驗室按正常晝夜節律，室溫約22～25℃。小鼠隨機分為4組：健康對照組、肺氣腫組、戒煙組、SAM干預組，每組各8只。本次研究經過貴州省人民醫院醫學倫理委員會同意（
1.2 方法
1.2.1 CSE制備
CSE制備方法參照文獻[6]進行。每支去濾嘴芙蓉牌香煙充分燃燒，所有煙霧負壓下通過收集瓶溶解在4 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中作為100% CSE。用0.22 μm 孔過濾器濾除CSE的顆粒和細菌，調節pH 7.20～7.40。每次實驗前30 min制備。
1.2.2 小鼠肺氣腫模型建立以及SAM干預方法
肺氣腫模型建立、CSE劑量、SAM劑量參照文獻[6-8]及預實驗。除健康對照組外的3組小鼠給予CSE（0.3 mL/20 g）腹腔注射（第1天、11天、21天）聯合單純煙霧暴露8周建立小鼠肺氣腫模型，隨后戒煙組和SAM組開始戒煙8周。戒煙8周期間SAM干預組給予SAM（100 mg·kg-1·d-1）及PBS腹腔注射，戒煙組則予以等量PBS腹腔注射。健康對照組正常飼養8周。
1.2.3 支氣管肺泡灌洗液制備
將小鼠稱重后予以3%戊巴比妥（1 mL/kg）腹腔內注射麻醉[9]，眼眶后動脈取血處死。仰臥位固于操作臺，消毒后充分暴露氣管與雙肺，行氣管插管。參照文獻[10]報道的方法制備支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），置于–80℃冰箱凍存，待后續檢測。
1.2.4 BALF中MDA濃度、GSH濃度及SOD活力測定
參照試劑盒說明書進行檢測。MDA、GSH濃度及SOD活力檢測均按說明書提前配置液體及加樣，予分光光度計讀數，讀數后按公式進行計算。
1.2.5 制備肺組織病例切片及分析
取小鼠右下肺放入4%多聚甲醛中固定24～48 h，石蠟包埋、切片后行HE染色。在光鏡下計數，參照文獻[11]計算肺平均內襯間隔（mean linear intercept，MLI）、平均肺泡數（mean alveolar number，MAN）。病理組織切片均采用雙盲法讀片。
1.2.6 肺泡隔細胞凋亡測定
采用脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labelin，TUNEL）技術檢測肺泡隔細胞調亡，參照試劑盒說明書操作。光鏡下觀察，細胞核染色為棕褐色或棕黃色者為陽性細胞。參照Li等[8]所描述的方法計算肺泡隔細胞凋亡指數（apoptosis index，AI）。
1.3 統計學方法
采用SPSS 26.0對所有數據進行統計分析。數據結果經K-S檢驗符合正態分布，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 病理學變化
健康對照組氣管壁結構清楚，肺泡間隔完整，肺組織結構正常。肺氣腫組、戒煙組及SAM干預組肺組織切片可見局部區域肺泡擴張，部分肺泡間隔變窄，肺泡間隔斷裂導致相鄰肺泡融合成較大的囊腔，符合鏡下肺氣腫改變。SAM干預組病理切片肺泡擴張程度介于肺氣腫組及戒煙組之間。結果見圖1。
圖1
各組小鼠肺組織病理像（HE×100）
a. 健康對照組；b. 肺氣腫組；c. 戒煙組；d. SAM干預組。
4組MLI比較：肺氣腫組、戒煙組與SAM干預組較健康對照組增加，戒煙組較肺氣腫組增加，SAM干預組較戒煙組減小，差異均有統計學意義（P<0.05）。4組MAN比較：肺氣腫、戒煙組與SAM干預組較健康對照組減小，戒煙組較肺氣腫組減小，SAM干預組較戒煙組增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。結果見表1。
表1
各組小鼠肺組織中MLI、MAN比較（x±s，n=8）
2.2 BALF中MDA、SOD活力和GSH濃度水平的變化
與健康對照組比較，肺氣腫組、戒煙組及SAM干預組小鼠BALF中MDA 含量顯著升高，GSH含量和SOD活性均顯著降低。與肺氣腫組比較，戒煙組小鼠BALF中MDA含量顯著升高，GSH含量和SOD活力均顯著降低。與戒煙組比較，SAM干預組小鼠BALF中MDA含量顯著降低，GSH含量和SOD活力均顯著升高。差異均有統計學意義（P<0.05），結果見表2。
表2
各組小鼠BALF中氧化應激指標比較（x±s，n=8）
2.3 各組小鼠肺泡間隔AI比較
肺氣腫組、戒煙組、SAM干預組肺泡隔細胞AI比健康對照組明顯升高，戒煙組肺泡隔細胞AI比肺氣腫組明顯高，SAM干預組肺泡隔細胞AI較戒煙組降低，差異均有統計學意義（P<0.01），結果見圖2和表3。
圖2
各組小鼠肺泡隔細胞凋亡光鏡（TUNEL×400）
a. 健康對照組；b. 肺氣腫組；c. 戒煙組；d. SAM干預組。
表3
各組小鼠肺泡隔細胞AI比較（x±s，n=8）
3 討論
慢阻肺是一種嚴重危害人類健康的呼吸系統疾病，是全球第三大死因，居世界疾病經濟負擔第5位[12]，但其發病機制尚不完全明確，因此有待進一步的研究。眾所周知，吸煙是慢阻肺的主要危險因素，Josephs等[13]報道戒煙的慢阻肺患者的健康明顯好于持續吸煙者，強調了有效戒煙的重要性。然而，戒煙并不意味慢阻肺不會進展，研究表明一旦慢阻肺開始，肺部炎癥反應持續，并且在戒煙后肺氣腫持續進展[14- 15]。同時相關研究顯示氧化應激在慢阻肺的發生、發展過程中有重要作用[16-17]。本研究通過腹腔注射香煙煙霧提取物聯合香煙煙霧暴露構建小鼠肺氣腫模型，取小鼠右肺做病理切片及HE染色，鏡下發現煙霧暴露組呈肺氣腫改變，其MLI較健康對照組顯著增加，MAN較健康對照組顯著降低，與文獻報導結果[18]相似，證實肺氣腫模型構建成功。
SAM是廣泛存在于動植物體內的一種能改善細胞代謝的生物活性物質，參與多種關鍵的生化途徑，包括激素、重要蛋白和神經遞質的生物合成。研究發現SAM具有抗氧化作用[19]，通過提高抗氧化系統作用，維持氧化系統平衡，從而緩解或治療疾病。氧化應激是慢阻肺公認的發病機制之一，本課題組前期研究結果顯示SAM可能通過抑制氧化應激反應從而抑制大鼠自身免疫肺氣腫的形成[5]，但對戒煙后肺氣腫小鼠肺部病理的持續進展干預效果如何國內外尚無系統研究。鑒于目前國內戒煙后慢阻肺-肺氣腫患者眾多，但治療效果欠佳，本研究進行了針對性研究，選用SAM作為戒煙后藥物干預措施，以探討SAM在戒煙后小鼠肺氣腫病理變化中的干預作用及可能涉及的機制。本研究結果表明，肺氣腫組BALF中MDA濃度高于健康對照組，GSH濃度及SOD活力低于健康對照組，肺氣腫組AI高于健康對照組，因此考慮香煙相關小鼠肺氣腫形成可能與BALF中MDA升高和GSH、SOD降低相關。戒煙后肺氣腫小鼠BALF中MDA、MLI、肺泡隔凋亡指數持續升高，而GSH和SOD持續下降，表明肺氣腫小鼠戒煙后體內存在持續氧化應激失衡伴隨肺部病理的持續進展。因為戒煙同時予以SAM干預后上述指標較未戒煙小鼠好轉，結合相關研究發現外源性補充SAM可降低細胞凋亡水平[8]，因此我們認為SAM能夠緩解戒煙后肺氣腫的持續進展，可能與其抗氧化應激及降低細胞凋亡作用相關。
目前抑制慢阻肺持續進展的藥物價格較高，且效果有限，亟待開發新的藥物進行干預。SAM價格優廉且不良反應小，臨床上已有成功治療抑郁癥、肝內膽汁淤積、腫瘤等方面的報道[20-21]，因此可能在臨床上慢阻肺-肺氣腫戒煙患者中推廣應用以延緩其疾病進展。但目前其相關研究局限于動物實驗，在慢阻肺、肺氣腫患者需要進一步開展臨床研究證實該藥的作用。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種以持續的呼吸道癥狀和不可逆的氣流受限為特征的慢性呼吸道疾病，以肺氣腫和慢性支氣管炎為主要病理改變。慢阻肺患病率及病死率較高，嚴重威脅人們健康。目前，吸煙是慢阻肺公認的主要病因及誘因，但臨床發現許多患者戒煙之后氣道炎癥及肺泡損害持續存在，甚至不斷進展導致肺功能進行性惡化[1]。研究發現香煙煙霧可通過誘導炎癥反應、氧化應激和肺泡隔細胞凋亡等不同途徑參與慢阻肺或肺氣腫的發生、發展[1-2]。而氧化應激、肺泡隔細胞凋亡與戒煙后肺氣腫變化的關系以及藥物干預等，目前尚無系統研究。S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-l-methionine，SAM）是一種能改善細胞代謝的生物活性物質，可參與多種生化反應，具有抗氧化作用[3-4]。我們前期研究發現SAM可通過抗氧化機制抑制大鼠自身免疫肺氣腫的形成[5]，但SAM能否抑制戒煙后小鼠肺氣腫的進展國內外尚無文獻報導。本研究通過腹腔注射香煙煙霧提取物聯合香煙煙霧暴露建立小鼠肺氣腫模型，檢測肺泡灌洗液中丙二醛（malondialdehyde ，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）濃度和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及肺泡隔細胞凋亡、肺組織病理形態學改變等，評估SAM 的干預效果，為臨床上探討戒煙后肺氣腫持續進展的發病機制及尋求新的治療方法提供線索。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗材料與試劑：自制有機玻璃煙熏艙1個（規格55 cm×43 cm×40 cm）；黃果樹牌香煙，每支煙草含焦油量12 mg，煙堿含量1.1 mg；芙蓉牌香煙，每支煙草含焦油13 mg，尼古丁1.0 mg，一氧化碳14 mg。MDA試劑盒、SOD試劑盒、GSH測試盒購于南京建成生物工程研究所。蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）染色液（北京索萊寶生物技術有限公司）。SAM為注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸（意大利AB-BOTTS.R.L）。
實驗動物及分組：SPF級C57BL/6J小鼠［購自重慶市騰鑫科技公司，許可證號SCXK（京）2019-0010］32只，雄性，6～8周齡，體重18～20 g，飼養于貴州中醫藥大學實驗動物研究所。實驗室按正常晝夜節律，室溫約22～25℃。小鼠隨機分為4組：健康對照組、肺氣腫組、戒煙組、SAM干預組，每組各8只。本次研究經過貴州省人民醫院醫學倫理委員會同意（
1.2 方法
1.2.1 CSE制備
CSE制備方法參照文獻[6]進行。每支去濾嘴芙蓉牌香煙充分燃燒，所有煙霧負壓下通過收集瓶溶解在4 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中作為100% CSE。用0.22 μm 孔過濾器濾除CSE的顆粒和細菌，調節pH 7.20～7.40。每次實驗前30 min制備。
1.2.2 小鼠肺氣腫模型建立以及SAM干預方法
肺氣腫模型建立、CSE劑量、SAM劑量參照文獻[6-8]及預實驗。除健康對照組外的3組小鼠給予CSE（0.3 mL/20 g）腹腔注射（第1天、11天、21天）聯合單純煙霧暴露8周建立小鼠肺氣腫模型，隨后戒煙組和SAM組開始戒煙8周。戒煙8周期間SAM干預組給予SAM（100 mg·kg-1·d-1）及PBS腹腔注射，戒煙組則予以等量PBS腹腔注射。健康對照組正常飼養8周。
1.2.3 支氣管肺泡灌洗液制備
將小鼠稱重后予以3%戊巴比妥（1 mL/kg）腹腔內注射麻醉[9]，眼眶后動脈取血處死。仰臥位固于操作臺，消毒后充分暴露氣管與雙肺，行氣管插管。參照文獻[10]報道的方法制備支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），置于–80℃冰箱凍存，待后續檢測。
1.2.4 BALF中MDA濃度、GSH濃度及SOD活力測定
參照試劑盒說明書進行檢測。MDA、GSH濃度及SOD活力檢測均按說明書提前配置液體及加樣，予分光光度計讀數，讀數后按公式進行計算。
1.2.5 制備肺組織病例切片及分析
取小鼠右下肺放入4%多聚甲醛中固定24～48 h，石蠟包埋、切片后行HE染色。在光鏡下計數，參照文獻[11]計算肺平均內襯間隔（mean linear intercept，MLI）、平均肺泡數（mean alveolar number，MAN）。病理組織切片均采用雙盲法讀片。
1.2.6 肺泡隔細胞凋亡測定
采用脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labelin，TUNEL）技術檢測肺泡隔細胞調亡，參照試劑盒說明書操作。光鏡下觀察，細胞核染色為棕褐色或棕黃色者為陽性細胞。參照Li等[8]所描述的方法計算肺泡隔細胞凋亡指數（apoptosis index，AI）。
1.3 統計學方法
采用SPSS 26.0對所有數據進行統計分析。數據結果經K-S檢驗符合正態分布，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 病理學變化
健康對照組氣管壁結構清楚，肺泡間隔完整，肺組織結構正常。肺氣腫組、戒煙組及SAM干預組肺組織切片可見局部區域肺泡擴張，部分肺泡間隔變窄，肺泡間隔斷裂導致相鄰肺泡融合成較大的囊腔，符合鏡下肺氣腫改變。SAM干預組病理切片肺泡擴張程度介于肺氣腫組及戒煙組之間。結果見圖1。
圖1
各組小鼠肺組織病理像（HE×100）
a. 健康對照組；b. 肺氣腫組；c. 戒煙組；d. SAM干預組。
4組MLI比較：肺氣腫組、戒煙組與SAM干預組較健康對照組增加，戒煙組較肺氣腫組增加，SAM干預組較戒煙組減小，差異均有統計學意義（P<0.05）。4組MAN比較：肺氣腫、戒煙組與SAM干預組較健康對照組減小，戒煙組較肺氣腫組減小，SAM干預組較戒煙組增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。結果見表1。
表1
各組小鼠肺組織中MLI、MAN比較（x±s，n=8）
2.2 BALF中MDA、SOD活力和GSH濃度水平的變化
與健康對照組比較，肺氣腫組、戒煙組及SAM干預組小鼠BALF中MDA 含量顯著升高，GSH含量和SOD活性均顯著降低。與肺氣腫組比較，戒煙組小鼠BALF中MDA含量顯著升高，GSH含量和SOD活力均顯著降低。與戒煙組比較，SAM干預組小鼠BALF中MDA含量顯著降低，GSH含量和SOD活力均顯著升高。差異均有統計學意義（P<0.05），結果見表2。
表2
各組小鼠BALF中氧化應激指標比較（x±s，n=8）
2.3 各組小鼠肺泡間隔AI比較
肺氣腫組、戒煙組、SAM干預組肺泡隔細胞AI比健康對照組明顯升高，戒煙組肺泡隔細胞AI比肺氣腫組明顯高，SAM干預組肺泡隔細胞AI較戒煙組降低，差異均有統計學意義（P<0.01），結果見圖2和表3。
圖2
各組小鼠肺泡隔細胞凋亡光鏡（TUNEL×400）
a. 健康對照組；b. 肺氣腫組；c. 戒煙組；d. SAM干預組。
表3
各組小鼠肺泡隔細胞AI比較（x±s，n=8）
3 討論
慢阻肺是一種嚴重危害人類健康的呼吸系統疾病，是全球第三大死因，居世界疾病經濟負擔第5位[12]，但其發病機制尚不完全明確，因此有待進一步的研究。眾所周知，吸煙是慢阻肺的主要危險因素，Josephs等[13]報道戒煙的慢阻肺患者的健康明顯好于持續吸煙者，強調了有效戒煙的重要性。然而，戒煙并不意味慢阻肺不會進展，研究表明一旦慢阻肺開始，肺部炎癥反應持續，并且在戒煙后肺氣腫持續進展[14- 15]。同時相關研究顯示氧化應激在慢阻肺的發生、發展過程中有重要作用[16-17]。本研究通過腹腔注射香煙煙霧提取物聯合香煙煙霧暴露構建小鼠肺氣腫模型，取小鼠右肺做病理切片及HE染色，鏡下發現煙霧暴露組呈肺氣腫改變，其MLI較健康對照組顯著增加，MAN較健康對照組顯著降低，與文獻報導結果[18]相似，證實肺氣腫模型構建成功。
SAM是廣泛存在于動植物體內的一種能改善細胞代謝的生物活性物質，參與多種關鍵的生化途徑，包括激素、重要蛋白和神經遞質的生物合成。研究發現SAM具有抗氧化作用[19]，通過提高抗氧化系統作用，維持氧化系統平衡，從而緩解或治療疾病。氧化應激是慢阻肺公認的發病機制之一，本課題組前期研究結果顯示SAM可能通過抑制氧化應激反應從而抑制大鼠自身免疫肺氣腫的形成[5]，但對戒煙后肺氣腫小鼠肺部病理的持續進展干預效果如何國內外尚無系統研究。鑒于目前國內戒煙后慢阻肺-肺氣腫患者眾多，但治療效果欠佳，本研究進行了針對性研究，選用SAM作為戒煙后藥物干預措施，以探討SAM在戒煙后小鼠肺氣腫病理變化中的干預作用及可能涉及的機制。本研究結果表明，肺氣腫組BALF中MDA濃度高于健康對照組，GSH濃度及SOD活力低于健康對照組，肺氣腫組AI高于健康對照組，因此考慮香煙相關小鼠肺氣腫形成可能與BALF中MDA升高和GSH、SOD降低相關。戒煙后肺氣腫小鼠BALF中MDA、MLI、肺泡隔凋亡指數持續升高，而GSH和SOD持續下降，表明肺氣腫小鼠戒煙后體內存在持續氧化應激失衡伴隨肺部病理的持續進展。因為戒煙同時予以SAM干預后上述指標較未戒煙小鼠好轉，結合相關研究發現外源性補充SAM可降低細胞凋亡水平[8]，因此我們認為SAM能夠緩解戒煙后肺氣腫的持續進展，可能與其抗氧化應激及降低細胞凋亡作用相關。
目前抑制慢阻肺持續進展的藥物價格較高，且效果有限，亟待開發新的藥物進行干預。SAM價格優廉且不良反應小，臨床上已有成功治療抑郁癥、肝內膽汁淤積、腫瘤等方面的報道[20-21]，因此可能在臨床上慢阻肺-肺氣腫戒煙患者中推廣應用以延緩其疾病進展。但目前其相關研究局限于動物實驗，在慢阻肺、肺氣腫患者需要進一步開展臨床研究證實該藥的作用。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
