引用本文： 胡小娟, 曼古努·石那別克, 胡昕, 于敏杰, 閆芳. 去整合素金屬蛋白酶33對氣道血管內皮細胞增殖和管腔形成的影響及作用機制. 中國呼吸與危重監護雜志, 2024, 23(8): 569-574. doi: 10.7507/1671-6205.202404057 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國呼吸與危重監護雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
支氣管哮喘（簡稱哮喘）的病因和發病機制復雜，氣道炎癥反應、氣道高反應性及氣道重塑為其三大特征。氣道重塑是指包括細支氣管在內的一系列氣道形態學改變，涵蓋了上皮、基底膜、平滑肌和血管在內的氣管壁全層[1]。研究發現無論成人還是兒童哮喘中存在氣道粘膜下層和固有層微血管數量的增加，并與疾病嚴重程度相關[2]。由此可見，哮喘氣道重塑的進程還包括氣道血管的再生和重塑。去整合素金屬蛋白酶33（adisintegrin and metalloproteinase，ADAM33）是ADAM家族成員之一，已被確定為哮喘易感基因[3]。研究證實ADAM33可從促進氣道上皮細胞間充質轉化[4]、調控成纖維細胞分化和增殖[5]、改變氣道平滑肌細胞增殖能力和機械行為[6]、調節氣道新生血管生成[7]等多個方面參與哮喘氣道重塑。課題組先前研究結果表明輕至重度的哮喘患者都存在氣道血管重塑，ADAM33的表達水平與哮喘患者氣道血管重塑的嚴重程度密切相關；且ADAM33的異常表達能夠調控氣道VSMCs的表型變化，在氣道血管重塑中發揮作用[8]。VECs同樣是氣道血管重塑和血管形成的主要效應細胞，與VSMCs在結構上相鄰，在功能上交互調控。VECs的細胞膜上大量受體可探測周圍環境的變化，通過一定的信號轉導機制將各種刺激信號轉導至細胞內[9]。VECs自身ADAM33 mRNA表達水平很低，有研究發現可溶性ADAM33（sADAM33）在體外能快速誘導內皮細胞分化，誘導新生血管形成[10]。本研究通過氣道VSMCs和VECs共培養實驗，探討sADAM33的表達對VECs增殖和管腔形成的影響及可能的分子機制。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 試驗細胞
人肺微血管內皮細胞（Human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMECs）、人氣道平滑肌細胞 （Human airway smooth muscle cells，HASMC）來源于普諾賽生物有限公司，分別使用專用培養基培養，培養環境：37℃，5% CO2，飽和濕度。
1.1.2 試劑與抗體
陰性對照病毒、LV-ADAM33-shRNA購自上海漢恒生物科技有限公司。ELISA試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司。山羊抗兔IgG H&L（HRP）、山羊抗小鼠IgG H&L（HRP）、重組Anti-mTOR抗體［EPR390（N）］、重組Anti-mTOR（phospho S2448）抗體［EPR426（2）］、重組Anti-TIE2抗體［EPR21915］、Anti-AKT3 （phospho S472） + AKT2 （phospho S474） + AKT1 （phospho S473）抗體［EPR18853］等購自英國Abcam公司。Tris、SDS、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、Glycine、glycerine、Tween 20購自上海Sangon Biotech有限公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
從液氮中取出凍存的HASMCs、HPMECs原代細胞，將解凍后的細胞接種到培養瓶中，在37℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養箱中培養。細胞傳代3-6代用于后續實驗。
1.2.2 慢病毒轉染基因沉默
選用干擾載體pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO設計和合成均由上海吉凱基因科技有限公司完成。轉染最佳MOI為1×107 TU/mL，P助感染液，感染時間72h。在2×105/mL懸浮的HASMCs中加入polybrene至6 μg/mL和適量病毒，充分混勻。37℃孵育，或者150 g室溫離心4 h。于離心結束后加入等體積新鮮培養基以稀釋polybrene，繼續培養72 h。收集細胞，評價轉染效果。
1.2.3 細胞共培養與實驗分組
取對數生長期的HASMCs及HPMECs，消化后移入1.5 mL滅菌離心管中，離心去除細胞碎片，調整細胞濃度為5×105個/mL；將HPMECs接種至Transwell小室的上室，100 μL/孔，HASMCs接種在Transwell小室的下室，500 μL/孔，培養24h細胞貼壁后按不同實驗分組進行干預。分組如下：內皮細胞空白組（HPMECs正常培養72 h）、共培養組（HPMECs+HASMCs共培養72 h）、共培養+shRNA陰性對照組（轉染陰性對照病毒并共培養72 h）、共培養+ADAM33-shRNA組（轉染ADAM33-shRNA病毒并共培養72 h）。
1.2.4 CCK8細胞增殖實驗
按1.2.3細胞分組及干預方法進行干預，每組5個重復。干預完成后，取出Transwell小室，棄去下室培養基，每孔加入200μL配置好的10% CCK-8溶液，繼續在培養箱中孵育1h，將上清液轉移至96孔板中，用酶標儀測定450 nm處的OD值。
1.2.5 Transwell管腔形成實驗
取50 μL/孔Matrigel基質膠加入預冷的48孔板中，置于細胞培養箱中60 min進行凝固。收集干預后的HPMECs，消化并調整為細胞濃度1×105cells/mL的單細胞懸液。在凝固后的Matrigel基質膠中每孔加入200 μL細胞懸液，標記后常規培養24 h，用顯微鏡觀察并拍照，并用Image j軟件計算血管長度。
1.2.6 ELISA
取出樣本試劑，設立樣本標準曲線，進行加樣、孵育、洗滌、顯色、中止、酶標儀檢測，通過酶標物顯色的深淺間接定量檢測細胞共培養體系中不同處理組sADAM33、VEGFA、VEGFR2和ang-1、ang-2的表達。
1.2.7 Western
Blotting
收集不同干預組細胞，加入100 μLRIPA裂解液提取總蛋白。使用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid method，BCA）測定蛋白濃度，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察蛋白質。分離蛋白后，用250mA電流將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜中，使用含5%脫脂奶粉的封閉液。封閉轉印膜1 h后TBST漂洗。用TBST稀釋一抗Tie2、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR，在4 ℃孵育過夜，TBST漂洗后加入稀釋二抗，室溫孵育2 h，再次TBST漂洗。膜上加入顯影液，用ChemiScope mini化學發光儀檢測、拍照。
1.3 統計學分析
所有數據采用均值±標準差（x±s）表示，運用SPSS19.0軟件進行統計學分析，符合正態性、方差齊的多組間均數比較采用單因素方差分析，兩組間均數比較采用兩獨立樣本的t檢驗；若不符合正態性，對數據進行對數轉化，使其正態化再行比較；若方差不齊時，采用Tamhane方法進行多重比較。P<0.05表示差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 細胞增殖實驗
各處理組間OD值的比較具有明顯差異（P<0.05）；內皮細胞空白組的OD值明顯低于共培養組、共培養+shRNA陰性對照組和共培養+ADAM33shRNA組，差異具有統計學意義（P<0.05）；共培養+ADAM33shRNA組OD值低于共培養組和共培養+shRNA陰性對照組（P<0.05）。見圖1、表1。
圖1
細胞增殖實驗光學顯微鏡圖（×100）
注：a. 內皮細胞空白組；b. 共培養組；c. 共培養+shRNA陰性對照組；d. 共培養+ADAM33-shRNA組
表1
各處理組OD值比較（x±s，n=5）
2.2 管腔形成實驗
各處理組之間平均成管長度比較具有明顯統計學差異（P<0.05）。共培養組、共培養+shRNA陰性對照組之間成管長度未見統計學差異（P>0.05），但平均成管長度顯著高于內皮細胞空白組和共培養+ADAM33-shRNA組（P<0.05）；與內皮細胞空白組相比，共培養+ADAM33-shRNA組的成管長度明顯增加（P<0.05）。見圖2、表2。
圖2
Transwell管腔形成實驗顯微鏡圖（×100）
注：a. 內皮細胞空白組；b. 共培養組；c. 共培養+shRNA陰性對照組；d. 共培養+ADAM33-shRNA組
表2
各處理組成管長度比較（x±s，n=5）
2.3 sADAM33和促血管生成因子的表達
內皮細胞空白組中sADAM33含量明顯低于其他三組（P<0.05）；共培養+ADAM33-shRNA組中sADAM33含量低于共培養組和共培養+shRNA陰性對照組（P<0.05）。各處理組細胞共培養上清液中VEGFA、VEGFR2，ang-1和ang-2的表達水平具有明顯統計學差異（P<0.05）；與內皮細胞空白組相比，共培養組、共培養+shRNA陰性對照組、共培養+ADAM33-shRNA組的VEGFR2、ang-2表達水平明顯增高（P<0.05）；共培養+ADAM33-shRNA組VEGFA、VEGFR2，ang-1和ang-2的表達顯著低于共培養組和共培養+ADAM33-shRNA組。見表3。
表3
共培養體系中sADAM33、VEGFA、VEGFR2、ang-1、ang-2表達水平
2.4 Tie2/PI3K/Akt/mTOR通路變化
各處理組Tie2、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平均具有統計學差異（P<0.05）；Tie2、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達在內皮細胞空白組較其余三組組顯著降低（P<0.05）；在共培養+ADAM33-shRNA組較共培養組、共培養+shRNA陰性對照組減低（P<0.05）；而Tie2、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達在共培養組、共培養+shRNA陰性對照組之間未顯示出統計學差異（P>0.05）。見圖3、表4.
圖3
Tie2/PI3K/Akt/mTOR信號通路靶蛋白表達WB條帶圖
表4
Tie2/PI3K/Akt/mTOR通路靶蛋白表達量的比較
3 討論
哮喘發病機制復雜，涉及氣道炎癥、遺傳免疫、環境暴露、呼吸道病毒感染、氣道神經調節及神經信號轉導等[11]。現有研究表明基因在哮喘的發病過程中發揮了重要作用，認為哮喘是一種多基因遺傳病，與個體變應性體質和環境因素有關，具有明顯的遺傳傾向和家族聚集性[12]。氣道炎癥反應、氣道高反應性及氣道重塑為其三大特征，其中氣道血管的再生與重塑又是氣道重塑的主要特征[13]。
ADAM33是第一個通過定位克隆發現的哮喘易感基因，與哮喘疾病特征性的氣道高反應、氣道炎癥和組織重構顯著相關[3,14]。國內外諸多研究報道指出ADAM33基因的表達變化可能是哮喘氣道重塑、氣道高反應相關的效應細胞功能失調的始動因素[15]。研究顯示支氣管哮喘患者肺功能下降及氣道高反應性與ADAM33蛋白水解酶活性提升相關，ADAM33蛋白水解酶參與氣道重塑和不可逆性狹窄等病理過程[16]。課題組此前研究表明ADAM33在哮喘患者氣道VSMCs中組成性表達，ADAM33基因沉默可經調控PI3K/Akt信號通路影響VSMCs的增殖和凋亡[17]，進而參與氣道血管重塑。sADAM33是ADAM33的一種可溶形式，在哮喘患者氣道平滑肌和基底膜組織中均呈現異常高表達，與哮喘病情的加重、肺功能的降低及氣道超敏反應、炎癥和重塑程度有關[18-19]。研究者發現sADAM33蛋白對血管內皮細胞的分化具有效促作用，能夠加速新生血管的產生[10]。與既往文獻結果一致，本研究檢測到VECs中ADAM33 mRNA表達含量低，而與VECs在結構上相鄰的間充質細胞（主要是VSMCs）中 ADAM33 mRNA高表達[20-21]，因此設想VSMCs膜上釋放的含有金屬酶催化結構域的sADAM33可能會影響內皮細胞的生物學行為。由于從哮喘患者的氣道血管中分離提取血管平滑肌細胞、血管內皮細胞所需組織標本量大，本實驗選擇以原代細胞株作為研究對象。在單純內皮細胞培養組檢測到sADAM33含量很低，共培養體系中sADAM33主要是從HASMCs的細胞膜釋放而來，其表達含量隨著沉默HASMCs的ADAM33基因而減低。CCK8細胞增殖和Transwell管腔形成實驗顯示共培養組HPMECs的增殖能力和管腔形成較內皮細胞培養組顯著增強，但若沉默共培養體系中HASMCs的ADAM33基因表達，HPMECs則呈現出細胞增殖和管腔形成能力明顯下降。以上結果證明了VSMCs產生釋放的sADAM33能夠調控與其位置毗鄰的VECs增殖和管腔形成能力，參與哮喘氣道血管再生和血管重塑。
血管內皮生長因子（VEGF）是參與調控血管內皮細胞生長增殖最為重要因子之一[22]，VEGF作用的發揮有賴于其與血管內皮細胞特異性受體結合，進而激活體內信號傳導發揮其生物學效應[18]。VEGFR2作為重要的血管生長因子受體，可被VEGF121-VEGF165融合體靶向調控，進而激活下游PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制血管新生與重塑。相關文獻報道，VEGFR2調控血管新生與重塑功能發揮與調控VEGF、IKKs/IκBα/NF-κB、Src/FAK/ERK1/2、AKT通路等多條信號途徑有關[22-25]。研究發現血管生成素ang-1和ang-2能夠促進毛細血管直徑快速增加，增強內皮細胞的增殖和遷移，重塑基板和刺激新血管的生成[26]。Tie2是一種重要的內皮特異性受體酪氨酸激酶，Tie2及其配體有助于血管發生和再生[27]。Tie2下游的PI3K/Akt/mTOR信號通路參與調控增殖、粘附、遷移、侵襲、代謝、生存等細胞原始行為反應，這一過程同時也調控新生血管萌芽期間內皮細胞的功能，在血管新生及重塑等疾病中發揮關鍵作用[28]。且有文獻提到非Th2細胞因子（VEGF、SDF-1和CXCR4）水平升高，可激活AMPK導致血管生成相關因子顯著降低，包括VEGF和MMP-9，從而減輕哮喘患者的新生血管的形成[29]。通過細胞共培養實驗，我們發現沉默氣道VSMCs的ADAM33基因表達能夠減少sADAM33的釋放，同時檢測到共培養體系中促血管生成因子VEGFA、VEGFR2、ang-1、ang-2表達降低，并且Tie2/PI3K/Akt/mTOR信號通路活性受抑，說明sADAM33異常表達能夠影響VECs增殖和管腔形成，除VEGF/VEGFR2為重要的機制外，Tie2/PI3K/Akt/mTOR信號通路也參與在內，其中由于VEGF的存在，ang-2與ang-1能夠協同起效，一同參與氣道血管重塑。
綜上所述，細胞共培養實驗應證了氣道VSMCs和VECs之間的信息傳遞和交互作用，雖然ADAM33在VECs表達量極低，但來自于VSMCs釋放的sADAM33可經由Tie2/PI3K/Akt/mTOR信號通路調控VECs的增殖和管腔形成，從而參與哮喘氣道血管重塑。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
支氣管哮喘（簡稱哮喘）的病因和發病機制復雜，氣道炎癥反應、氣道高反應性及氣道重塑為其三大特征。氣道重塑是指包括細支氣管在內的一系列氣道形態學改變，涵蓋了上皮、基底膜、平滑肌和血管在內的氣管壁全層[1]。研究發現無論成人還是兒童哮喘中存在氣道粘膜下層和固有層微血管數量的增加，并與疾病嚴重程度相關[2]。由此可見，哮喘氣道重塑的進程還包括氣道血管的再生和重塑。去整合素金屬蛋白酶33（adisintegrin and metalloproteinase，ADAM33）是ADAM家族成員之一，已被確定為哮喘易感基因[3]。研究證實ADAM33可從促進氣道上皮細胞間充質轉化[4]、調控成纖維細胞分化和增殖[5]、改變氣道平滑肌細胞增殖能力和機械行為[6]、調節氣道新生血管生成[7]等多個方面參與哮喘氣道重塑。課題組先前研究結果表明輕至重度的哮喘患者都存在氣道血管重塑，ADAM33的表達水平與哮喘患者氣道血管重塑的嚴重程度密切相關；且ADAM33的異常表達能夠調控氣道VSMCs的表型變化，在氣道血管重塑中發揮作用[8]。VECs同樣是氣道血管重塑和血管形成的主要效應細胞，與VSMCs在結構上相鄰，在功能上交互調控。VECs的細胞膜上大量受體可探測周圍環境的變化，通過一定的信號轉導機制將各種刺激信號轉導至細胞內[9]。VECs自身ADAM33 mRNA表達水平很低，有研究發現可溶性ADAM33（sADAM33）在體外能快速誘導內皮細胞分化，誘導新生血管形成[10]。本研究通過氣道VSMCs和VECs共培養實驗，探討sADAM33的表達對VECs增殖和管腔形成的影響及可能的分子機制。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 試驗細胞
人肺微血管內皮細胞（Human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMECs）、人氣道平滑肌細胞 （Human airway smooth muscle cells，HASMC）來源于普諾賽生物有限公司，分別使用專用培養基培養，培養環境：37℃，5% CO2，飽和濕度。
1.1.2 試劑與抗體
陰性對照病毒、LV-ADAM33-shRNA購自上海漢恒生物科技有限公司。ELISA試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司。山羊抗兔IgG H&L（HRP）、山羊抗小鼠IgG H&L（HRP）、重組Anti-mTOR抗體［EPR390（N）］、重組Anti-mTOR（phospho S2448）抗體［EPR426（2）］、重組Anti-TIE2抗體［EPR21915］、Anti-AKT3 （phospho S472） + AKT2 （phospho S474） + AKT1 （phospho S473）抗體［EPR18853］等購自英國Abcam公司。Tris、SDS、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、Glycine、glycerine、Tween 20購自上海Sangon Biotech有限公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
從液氮中取出凍存的HASMCs、HPMECs原代細胞，將解凍后的細胞接種到培養瓶中，在37℃、飽和濕度、5%CO2細胞培養箱中培養。細胞傳代3-6代用于后續實驗。
1.2.2 慢病毒轉染基因沉默
選用干擾載體pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO設計和合成均由上海吉凱基因科技有限公司完成。轉染最佳MOI為1×107 TU/mL，P助感染液，感染時間72h。在2×105/mL懸浮的HASMCs中加入polybrene至6 μg/mL和適量病毒，充分混勻。37℃孵育，或者150 g室溫離心4 h。于離心結束后加入等體積新鮮培養基以稀釋polybrene，繼續培養72 h。收集細胞，評價轉染效果。
1.2.3 細胞共培養與實驗分組
取對數生長期的HASMCs及HPMECs，消化后移入1.5 mL滅菌離心管中，離心去除細胞碎片，調整細胞濃度為5×105個/mL；將HPMECs接種至Transwell小室的上室，100 μL/孔，HASMCs接種在Transwell小室的下室，500 μL/孔，培養24h細胞貼壁后按不同實驗分組進行干預。分組如下：內皮細胞空白組（HPMECs正常培養72 h）、共培養組（HPMECs+HASMCs共培養72 h）、共培養+shRNA陰性對照組（轉染陰性對照病毒并共培養72 h）、共培養+ADAM33-shRNA組（轉染ADAM33-shRNA病毒并共培養72 h）。
1.2.4 CCK8細胞增殖實驗
按1.2.3細胞分組及干預方法進行干預，每組5個重復。干預完成后，取出Transwell小室，棄去下室培養基，每孔加入200μL配置好的10% CCK-8溶液，繼續在培養箱中孵育1h，將上清液轉移至96孔板中，用酶標儀測定450 nm處的OD值。
1.2.5 Transwell管腔形成實驗
取50 μL/孔Matrigel基質膠加入預冷的48孔板中，置于細胞培養箱中60 min進行凝固。收集干預后的HPMECs，消化并調整為細胞濃度1×105cells/mL的單細胞懸液。在凝固后的Matrigel基質膠中每孔加入200 μL細胞懸液，標記后常規培養24 h，用顯微鏡觀察并拍照，并用Image j軟件計算血管長度。
1.2.6 ELISA
取出樣本試劑，設立樣本標準曲線，進行加樣、孵育、洗滌、顯色、中止、酶標儀檢測，通過酶標物顯色的深淺間接定量檢測細胞共培養體系中不同處理組sADAM33、VEGFA、VEGFR2和ang-1、ang-2的表達。
1.2.7 Western
Blotting
收集不同干預組細胞，加入100 μLRIPA裂解液提取總蛋白。使用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid method，BCA）測定蛋白濃度，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察蛋白質。分離蛋白后，用250mA電流將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜中，使用含5%脫脂奶粉的封閉液。封閉轉印膜1 h后TBST漂洗。用TBST稀釋一抗Tie2、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR，在4 ℃孵育過夜，TBST漂洗后加入稀釋二抗，室溫孵育2 h，再次TBST漂洗。膜上加入顯影液，用ChemiScope mini化學發光儀檢測、拍照。
1.3 統計學分析
所有數據采用均值±標準差（x±s）表示，運用SPSS19.0軟件進行統計學分析，符合正態性、方差齊的多組間均數比較采用單因素方差分析，兩組間均數比較采用兩獨立樣本的t檢驗；若不符合正態性，對數據進行對數轉化，使其正態化再行比較；若方差不齊時，采用Tamhane方法進行多重比較。P<0.05表示差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 細胞增殖實驗
各處理組間OD值的比較具有明顯差異（P<0.05）；內皮細胞空白組的OD值明顯低于共培養組、共培養+shRNA陰性對照組和共培養+ADAM33shRNA組，差異具有統計學意義（P<0.05）；共培養+ADAM33shRNA組OD值低于共培養組和共培養+shRNA陰性對照組（P<0.05）。見圖1、表1。
圖1
細胞增殖實驗光學顯微鏡圖（×100）
注：a. 內皮細胞空白組；b. 共培養組；c. 共培養+shRNA陰性對照組；d. 共培養+ADAM33-shRNA組
表1
各處理組OD值比較（x±s，n=5）
2.2 管腔形成實驗
各處理組之間平均成管長度比較具有明顯統計學差異（P<0.05）。共培養組、共培養+shRNA陰性對照組之間成管長度未見統計學差異（P>0.05），但平均成管長度顯著高于內皮細胞空白組和共培養+ADAM33-shRNA組（P<0.05）；與內皮細胞空白組相比，共培養+ADAM33-shRNA組的成管長度明顯增加（P<0.05）。見圖2、表2。
圖2
Transwell管腔形成實驗顯微鏡圖（×100）
注：a. 內皮細胞空白組；b. 共培養組；c. 共培養+shRNA陰性對照組；d. 共培養+ADAM33-shRNA組
表2
各處理組成管長度比較（x±s，n=5）
2.3 sADAM33和促血管生成因子的表達
內皮細胞空白組中sADAM33含量明顯低于其他三組（P<0.05）；共培養+ADAM33-shRNA組中sADAM33含量低于共培養組和共培養+shRNA陰性對照組（P<0.05）。各處理組細胞共培養上清液中VEGFA、VEGFR2，ang-1和ang-2的表達水平具有明顯統計學差異（P<0.05）；與內皮細胞空白組相比，共培養組、共培養+shRNA陰性對照組、共培養+ADAM33-shRNA組的VEGFR2、ang-2表達水平明顯增高（P<0.05）；共培養+ADAM33-shRNA組VEGFA、VEGFR2，ang-1和ang-2的表達顯著低于共培養組和共培養+ADAM33-shRNA組。見表3。
表3
共培養體系中sADAM33、VEGFA、VEGFR2、ang-1、ang-2表達水平
2.4 Tie2/PI3K/Akt/mTOR通路變化
各處理組Tie2、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達水平均具有統計學差異（P<0.05）；Tie2、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達在內皮細胞空白組較其余三組組顯著降低（P<0.05）；在共培養+ADAM33-shRNA組較共培養組、共培養+shRNA陰性對照組減低（P<0.05）；而Tie2、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達在共培養組、共培養+shRNA陰性對照組之間未顯示出統計學差異（P>0.05）。見圖3、表4.
圖3
Tie2/PI3K/Akt/mTOR信號通路靶蛋白表達WB條帶圖
表4
Tie2/PI3K/Akt/mTOR通路靶蛋白表達量的比較
3 討論
哮喘發病機制復雜，涉及氣道炎癥、遺傳免疫、環境暴露、呼吸道病毒感染、氣道神經調節及神經信號轉導等[11]。現有研究表明基因在哮喘的發病過程中發揮了重要作用，認為哮喘是一種多基因遺傳病，與個體變應性體質和環境因素有關，具有明顯的遺傳傾向和家族聚集性[12]。氣道炎癥反應、氣道高反應性及氣道重塑為其三大特征，其中氣道血管的再生與重塑又是氣道重塑的主要特征[13]。
ADAM33是第一個通過定位克隆發現的哮喘易感基因，與哮喘疾病特征性的氣道高反應、氣道炎癥和組織重構顯著相關[3,14]。國內外諸多研究報道指出ADAM33基因的表達變化可能是哮喘氣道重塑、氣道高反應相關的效應細胞功能失調的始動因素[15]。研究顯示支氣管哮喘患者肺功能下降及氣道高反應性與ADAM33蛋白水解酶活性提升相關，ADAM33蛋白水解酶參與氣道重塑和不可逆性狹窄等病理過程[16]。課題組此前研究表明ADAM33在哮喘患者氣道VSMCs中組成性表達，ADAM33基因沉默可經調控PI3K/Akt信號通路影響VSMCs的增殖和凋亡[17]，進而參與氣道血管重塑。sADAM33是ADAM33的一種可溶形式，在哮喘患者氣道平滑肌和基底膜組織中均呈現異常高表達，與哮喘病情的加重、肺功能的降低及氣道超敏反應、炎癥和重塑程度有關[18-19]。研究者發現sADAM33蛋白對血管內皮細胞的分化具有效促作用，能夠加速新生血管的產生[10]。與既往文獻結果一致，本研究檢測到VECs中ADAM33 mRNA表達含量低，而與VECs在結構上相鄰的間充質細胞（主要是VSMCs）中 ADAM33 mRNA高表達[20-21]，因此設想VSMCs膜上釋放的含有金屬酶催化結構域的sADAM33可能會影響內皮細胞的生物學行為。由于從哮喘患者的氣道血管中分離提取血管平滑肌細胞、血管內皮細胞所需組織標本量大，本實驗選擇以原代細胞株作為研究對象。在單純內皮細胞培養組檢測到sADAM33含量很低，共培養體系中sADAM33主要是從HASMCs的細胞膜釋放而來，其表達含量隨著沉默HASMCs的ADAM33基因而減低。CCK8細胞增殖和Transwell管腔形成實驗顯示共培養組HPMECs的增殖能力和管腔形成較內皮細胞培養組顯著增強，但若沉默共培養體系中HASMCs的ADAM33基因表達，HPMECs則呈現出細胞增殖和管腔形成能力明顯下降。以上結果證明了VSMCs產生釋放的sADAM33能夠調控與其位置毗鄰的VECs增殖和管腔形成能力，參與哮喘氣道血管再生和血管重塑。
血管內皮生長因子（VEGF）是參與調控血管內皮細胞生長增殖最為重要因子之一[22]，VEGF作用的發揮有賴于其與血管內皮細胞特異性受體結合，進而激活體內信號傳導發揮其生物學效應[18]。VEGFR2作為重要的血管生長因子受體，可被VEGF121-VEGF165融合體靶向調控，進而激活下游PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制血管新生與重塑。相關文獻報道，VEGFR2調控血管新生與重塑功能發揮與調控VEGF、IKKs/IκBα/NF-κB、Src/FAK/ERK1/2、AKT通路等多條信號途徑有關[22-25]。研究發現血管生成素ang-1和ang-2能夠促進毛細血管直徑快速增加，增強內皮細胞的增殖和遷移，重塑基板和刺激新血管的生成[26]。Tie2是一種重要的內皮特異性受體酪氨酸激酶，Tie2及其配體有助于血管發生和再生[27]。Tie2下游的PI3K/Akt/mTOR信號通路參與調控增殖、粘附、遷移、侵襲、代謝、生存等細胞原始行為反應，這一過程同時也調控新生血管萌芽期間內皮細胞的功能，在血管新生及重塑等疾病中發揮關鍵作用[28]。且有文獻提到非Th2細胞因子（VEGF、SDF-1和CXCR4）水平升高，可激活AMPK導致血管生成相關因子顯著降低，包括VEGF和MMP-9，從而減輕哮喘患者的新生血管的形成[29]。通過細胞共培養實驗，我們發現沉默氣道VSMCs的ADAM33基因表達能夠減少sADAM33的釋放，同時檢測到共培養體系中促血管生成因子VEGFA、VEGFR2、ang-1、ang-2表達降低，并且Tie2/PI3K/Akt/mTOR信號通路活性受抑，說明sADAM33異常表達能夠影響VECs增殖和管腔形成，除VEGF/VEGFR2為重要的機制外，Tie2/PI3K/Akt/mTOR信號通路也參與在內，其中由于VEGF的存在，ang-2與ang-1能夠協同起效，一同參與氣道血管重塑。
綜上所述，細胞共培養實驗應證了氣道VSMCs和VECs之間的信息傳遞和交互作用，雖然ADAM33在VECs表達量極低，但來自于VSMCs釋放的sADAM33可經由Tie2/PI3K/Akt/mTOR信號通路調控VECs的增殖和管腔形成，從而參與哮喘氣道血管重塑。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
