煙草煙霧暴露通過TNF-α/Caspase-3/GSDME通路介導細胞焦亡促進骨骼肌萎縮_《中國呼吸與危重監護雜志》

作者：

譚玉芬 ¹ , 熊國林 ² , 葉園園 ¹ , 黃翠碧 ¹ , 韋鑫燕 ¹ , 李杰 ¹ , 黃麗華 ¹ ,  賓雁飛 ¹

1. 廣西醫科大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科（廣西南寧 530007）;
2. 廣西醫科大學公共衛生學院（廣西南寧 530021）;

關鍵詞：

煙草煙霧慢性阻塞性肺疾病骨骼肌萎縮與功能障礙半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 Gasdermin-E 焦亡

DOI：

10.7507/1671-6205.202408075

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的探討半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3 ，Caspase-3）/ Gasdermin-E （GSDME）介導的細胞焦亡在煙草煙霧（CS）暴露誘導的骨骼肌萎縮中的作用。方法將C57BL/6小鼠暴露于煙草煙霧24周，構建肺氣腫小鼠模型。HE染色觀察腓腸肌組織的形態學變化；免疫組化檢測腓腸肌中焦亡相關蛋白表達。用煙草煙霧提取物（CSE）處理C2C12小鼠骨骼肌細胞，建立體外骨骼肌萎縮模型。進一步采用Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK和GSDME抑制劑Dimethyl fumarate（DMF）處理C2C12細胞。觀察抑制Caspase-3/GSDME后對CSE誘導的骨骼肌萎縮的影響。用腫瘤壞死因子α（TNF-α）刺激骨骼肌細胞，觀察TNF-α對Caspase-3/GSDME蛋白表達和肌管的影響。Western blot用于測定Caspase-3和GSDME蛋白的表達水平； Hoechst33342/ Propidium Iodide（PI）雙染色檢測PI陽性細胞率；乳酸脫氫酶（LDH）釋放實驗檢測C2C12細胞的LDH釋放量；免疫熒光檢測C2C12肌管直徑變化。結果 CS誘導小鼠腓腸肌萎縮的同時伴隨著GSDME介導的焦亡增強（P<0.05）。體外實驗結果表明，與對照組相比，CSE組C2C12細胞 cleaved-caspase-3 、GSDME-N的蛋白表達顯著增高，PI陽性率和LDH釋放率增加，肌管直徑減小（P<0.05）。分別抑制Caspase-3和GSDME 均可明顯改善CSE誘導的骨骼肌細胞焦亡和肌管萎縮（P<0.05）。 TNF-α促進肌管萎縮和骨骼肌細胞 cleaved-caspase-3 、GSDME-N蛋白的表達。結論 CS可以通過TNF-α激活caspase-3/GSDME 通路介導的焦亡，促進骨骼肌萎縮。

引用本文： 譚玉芬, 熊國林, 葉園園, 黃翠碧, 韋鑫燕, 李杰, 黃麗華, 賓雁飛. 煙草煙霧暴露通過TNF-α/Caspase-3/GSDME通路介導細胞焦亡促進骨骼肌萎縮. 中國呼吸與危重監護雜志, 2024, 23(10): 710-718. doi: 10.7507/1671-6205.202408075 復制

煙草煙霧暴露引發的慢性肺部異常炎癥反應是慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD，簡稱慢阻肺）發病的主要因素^[1-2]。骨骼肌萎縮和功能障礙是慢阻肺最常見的肺外合并癥之一，高達34%的慢阻肺患者伴有骨骼肌萎縮和功能障礙^[3]，表現為顯著的肌肉萎縮、收縮能力下降和運動功能障礙，這些不僅影響患者的生活質量，還顯著增加了慢阻肺患者的死亡率和住院率，是預測慢阻肺死亡的獨立危險因素^[4-5]。但目前關于慢阻肺骨骼肌萎縮和功能障礙的分子機制仍未完全闡明。研究表明，細胞焦亡（pyroptosis）與骨骼肌萎縮和功能障礙有關^[6–8]。細胞焦亡是由GSDM家族（GSDMs）介導的具有免疫原性的程序性細胞死亡方式，可被多個胞外信號分子如 TNF-α識別并激活，GSDMs被活化的Caspase裂解以釋放具有細胞膜成孔功能的N-末端結構域，導致細胞內容物的釋放，誘導炎癥反應^[9]。研究顯示，GSDME被活化的caspase-3特異性切割，產生 GSDME-N 片段，該片段穿透細胞膜，從而誘導細胞焦亡^[10]。 Caspase-3/GSDME信號介導的焦亡參與了骨骼肌萎縮的發生發展^[11]。然而，長期的煙草煙霧暴露是否通過TNF-α激活Caspase-3/GSDME通路誘導骨骼肌細胞焦亡，從而促進骨骼肌萎縮，目前尚不清楚。本研究旨在探討煙草煙霧誘導骨骼肌萎縮的機制是否與Caspase-3/GSDME介導的焦亡有關，為慢阻肺相關骨骼肌萎縮的治療機制提供一種新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：C57BL/6小鼠（5~6周，18 ± 2 g）購自廣西醫科大學實驗動物中心。環境溫度、濕度適宜，光/暗周期為12 h/12 h，小鼠自由飲水和進食。本研究已通過廣西醫科大學實驗動物倫理委員會審批。

實驗材料：C2C12小鼠成肌細胞系（中國科學院上海細胞庫，SCSP-505），胎牛血清（Gibco，10099141C），馬血清（Vivacell，C2510-0500 ），DMEM 高糖培養基（Gibco，C11995500BT）。Caspase-3 抑制劑Z-DEVD-FMK （MedChemExpress，HY-12466），GSDME 抑制劑Dimethyl fumarate（DMF）（MedChemExpress ，HY-17363），重組TNF-α蛋白（Abclonal ，RP01071）。Caspase-3（Abclonal，A19654）、Cleaved- caspase-3（Abways，CY5501）、GSDME（Abclonal，A7432）、GSDME-N抗體（Abcam，ab215191）、 GAPDH（Proteintech，60004-1-Ig）、β-actin（Abclonal，AC026）、山羊抗兔熒光二抗（Cell Signaling Technology，#5151P ），MyHC（Santa Cruz，sc-376157），Cy3標記山羊抗小鼠（碧云天，A0521），DAPI（索萊寶，C0065）、BCA蛋白檢測試劑盒（碧云天，P10010）、Hoechst33342/碘化丙啶（PI）雙染色試劑盒（碧云天，C1056）及LDH細胞毒性檢測試劑盒（碧云天，C0016）。真龍牌香煙（廣西中煙工業有限責任公司）。

實驗儀器：細胞培養箱（Thermo Scientific 8000），倒置熒光顯微鏡（EVOS? FL Auto Imaging System），病理顯微鏡（OLYMPUS），低溫冷凍離心機（Eppendorf），電泳儀（BIORAD），酶標儀（BioTek Gen5）等。

1.2 方法

1.2.1 組織學分析

新鮮組織用 4% 多聚甲醛固定，然后脫水、石蠟包埋、切片，脫蠟、脫水，進行 HE 染色分析肌纖維的橫截面積（CSA）和形態。進一步將腓腸肌切片進行免疫組織化學染色，切片經抗原修復、3%過氧化氫孵育、封閉后，與一抗4 °C孵育過夜。第2天用二抗孵育，DAB 顯色，蘇木精復染。用病理顯微鏡拍照，每個切片隨機選取5個視野進行圖像采集，使用 ImageJ 軟件進行分析。

1.2.2 CS提取物（CS extract，CSE）的制備

參考文獻^[12]，將3支無濾嘴的香煙依次連接到含有3 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）的抽吸裝置上，點燃香煙，用50 ml注射器緩慢抽吸，煙霧被溶解在PBS中，pH調至7.4，然后經0.22 μm無菌過濾器過濾以制成CSE。測量CSE的光密度，并在1h內使用。

1.2.3 細胞模型建立與分組

將C2C12細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，置于37 ℃、5%CO₂的培養箱中培養。當細胞融合度達80%后更換含2%馬血清的分化培養基，誘導分化5天至肌管形成^[13]。將C2C12肌管分為對照組（Control組）、CSE組、CSE+100 μmol/L DMF組（CSE+DMF組）、CSE+50 μmol/L Z-DEVD-FMK 組（CSE+Z-DEVD-FMK組）、80ng/ml TNF-α組（TNF-α組）。Control組不做任何處理，CSE組用0.2%CSE處理24 h; CSE+DMF組用100 μmol/L DMF預處理C2C12細胞1h，再與0.2%CSE共處理24 h; CSE+Z-DEVD-FMK 組用50 μmol/L Z-DEVD-FMK預處理C2C12細胞1h，再用0.2%CSE處理24 h；TNF-α組用80 ng/ml 重組TNF-α蛋白干預24 h。

1.2.4 Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色

經過不同處理的細胞，用磷酸緩沖鹽水（PBS）洗滌，加入含Hoechst和PI的細胞染色緩沖液30min。用熒光顯微鏡捕獲細胞圖像。隨機選擇3個不同的視野，計算PI陽性細胞比例。

1.2.5 LDH釋放實驗

使用LDH檢測試劑盒檢測骨骼肌細胞LDH釋放率，根據說明書操作，取各孔細胞培養基與60μL LDH檢測工作液混合，避光孵育30 min。使用酶標儀測量各孔490 nm處光密度值。

1.2.6 Western blot法檢測 Caspase-3、GSDME蛋白表達

收集各組C2C12細胞經裂解后的蛋白，通過電泳分離，轉膜，封閉后。與一抗4 ℃孵育過夜，熒光二抗室溫孵育1 h。紅外熒光顯影儀觀察與分析蛋白條帶。

1.2.7 免疫熒光

4%多聚甲醛固定細胞20 min，置于0.25%Triton X-100通透15 min，3%BSA封閉1 h，隨后用MyHC抗體4?C孵育過夜。第2天用熒光二抗避光孵育1 h，DAPI染核5min，在熒光顯微鏡下觀察，MyHC表達陽性（紅色）表明該細胞是骨骼肌細胞。肌管直徑：使用 ImageJ 軟件，對每組中不少于100個肌管的直徑進行了測量，并取平均值^[14]。

1.2.8 動物分組與造模

C57BL/6小鼠隨機分為2組：對照（Control）組、CS組。CS組小鼠放進熏煙箱，點燃5支香煙，每次1 h，熏煙間隔0.5 h以上，每日4次，5天/周；Control組小鼠正常飼養。第24周實驗結束后取材，稱取小鼠腓腸肌（GM）重量，取右側腓腸肌用于組織學評估，左側腓腸肌組織用于進一步蛋白分析

1.3 統計學方法

數據用 Graph Prism 10.0 進行分析，以均數 ± 標準差（SD）表示。根據數據的分布情況，兩組比較時，采用學生 t 檢驗或 Mann-Whitney U 檢驗。多組間比較使用單因素方差分析或 Kruskal-Wallis 檢驗。P<0.05視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢性CS暴露對小鼠腓腸肌形態和焦亡相關蛋白cleaved-caspase-3、GSDME-N的影響

HE染色結果顯示，與對照組相比，CS組小鼠腓腸肌的肌纖維橫截面積（CSA）顯著降低（圖1a，b），CS組小鼠的腓腸肌重量明顯減輕，（180.83±5.31）mg vs（137±9.4） mg（P<0.05）（圖1c）。免疫組化結果顯示，CS組小鼠腓腸肌中Caspase-3和GSDME的陽性率較對照組顯著增加（P<0.05）（圖1d，e）。Western blot 結果顯示，與對照組相比， CS 組腓腸肌中 cleaved-caspase-3 及 GSDME-N 蛋白表達顯著升高（P<0.05）（圖1f，g，h）。表明慢性CS暴露誘導骨骼肌萎縮的同時伴隨著Caspase-3/GSDME介導的焦亡激活。

圖1 兩組小鼠腓腸肌的形態、重量和cleaved-caspase-3、GSDME-N蛋白表達比較

a. 腓腸肌的HE染色代表性圖像（x200）； b. 腓腸肌肌纖維橫截面積；c. 腓腸肌的重量; d. 小鼠GM的c-caspase-3、GSDME-N免疫組織化學染色圖像，（X200）；e. c-caspase-3和GSDME-N的免疫組織化學分析的定量; f. cleaved-caspase-3、GSDME-N蛋白表達的Western blot代表性圖像；g. cleaved-caspase-3的表達水平；h. GSDME-N的表達水平

圖選項

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《中國呼吸與危重監護雜志》

煙草煙霧暴露通過TNF-α/Caspase-3/GSDME通路介導細胞焦亡促進骨骼肌萎縮

摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 組織學分析

1.2.2 CS提取物（CS extract，CSE）的制備

1.2.3 細胞模型建立與分組

1.2.4 Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色

1.2.5 LDH釋放實驗

1.2.6 Western blot法檢測 Caspase-3、GSDME蛋白表達

1.2.7 免疫熒光

1.2.8 動物分組與造模

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 慢性CS暴露對小鼠腓腸肌形態和焦亡相關蛋白cleaved-caspase-3、GSDME-N的影響

2.2 CSE對骨骼肌細胞焦亡相關蛋白表達水平和肌管直徑的影響

2.3 抑制Caspase-3對CSE誘導的C2C12細胞焦亡相關蛋白，PI陽性率和肌管直徑的影響

2.4 抑制GSDME對CSE誘導的C2C12細胞焦亡相關蛋白、PI陽性率和肌管直徑的影響

2.5 抑制Caspase-3和GSDME對CSE誘導的C2C12細胞LDH釋放率的影響

2.6 TNF-α對C2C12細胞焦亡相關蛋白和肌管直徑的影響

3 討論

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 組織學分析

1.2.2 CS提取物（CS extract，CSE）的制備

1.2.3 細胞模型建立與分組

1.2.4 Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色

1.2.5 LDH釋放實驗

1.2.6 Western blot法檢測 Caspase-3、GSDME蛋白表達

1.2.7 免疫熒光

1.2.8 動物分組與造模

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 慢性CS暴露對小鼠腓腸肌形態和焦亡相關蛋白cleaved-caspase-3、GSDME-N的影響

2.2 CSE對骨骼肌細胞焦亡相關蛋白表達水平和肌管直徑的影響

2.3 抑制Caspase-3對CSE誘導的C2C12細胞焦亡相關蛋白，PI陽性率和肌管直徑的影響

2.4 抑制GSDME對CSE誘導的C2C12細胞焦亡相關蛋白、PI陽性率和肌管直徑的影響

2.5 抑制Caspase-3和GSDME對CSE誘導的C2C12細胞LDH釋放率的影響

2.6 TNF-α對C2C12細胞焦亡相關蛋白和肌管直徑的影響

3 討論

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