引用本文： 孟六陽, 張帥康, 宋成彬, 姜德友. 血漿脂質與神經退行性疾病的因果關系：雙向兩樣本孟德爾隨機化分析. 中國循證醫學雜志, 2024, 24(12): 1392-1399. doi: 10.7507/1672-2531.202403095 復制
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隨著醫療水平的進步和衛生服務的提高，全球人均預期壽命不斷提高，老年人口不斷增加，實現健康老齡化是一個巨大挑戰[1]。神經系統疾病在所有年齡段死亡人數中占比最高，也是造成過去十年非傳染性疾病中老年人死亡百分比變化最大的原因[2]。神經退行性疾病（neurodegenerative diseases，NDD）的特征是神經元之間的連接和通信中斷以及中樞或周圍神經系統的進行性功能喪失，導致運動和認知過程受損。NDD的主要類型包括阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）、肌萎縮側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和多發性硬化癥（multiple sclerosis，MS）。遺傳易感性是這些具有離散形態學和病理生理學特征的NDD發生的主要危險因素之一，說明退行性病變和遺傳因素有關[3]。目前NDD的治療僅限于對癥治療，迫切需要能夠阻止或減緩潛在神經退行性過程的治療方法。
脂質在體內分布廣泛，占細胞膜重量的50%，是血液代謝產物的重要組成部分[4]。脂質通常是疏水分子和組織的重要組成部分，在多種生物過程中發揮重要作用，比如信號傳導、能量代謝、免疫反應等[5]。脂質代謝與機體的生理、病理密切相關，并且在基因組到表型組的遺傳信息流動中，脂質組比轉錄組或蛋白質組更接近表型組。因此，脂質組學可以更好地為研究遺傳相關的NDD提供基因層面上的信息和見解[6]。脂質代謝紊亂引起的各種特異性蛋白聚集和沉積是NDD發病的重要危險因素，并且長期影響NDD的發病、進展和嚴重程度[7]。對NDD患者和動物模型的脂質組學分析也揭示了多種脂質水平的改變，包括膽固醇、甘油磷脂、鞘脂等[8,9]。為了進一步了解脂質和NDD之間的相互作用，并提出早期治療策略以改善和緩解相關疾病人群癥狀，有必要明確血漿脂質與NDD之間的潛在因果關系。但是由于觀察性研究存在混雜因素、反向因果、測量誤差等局限性，無法提供因果聯系的直接證據。
孟德爾隨機化（Mendelian randomization，MR）分析是一種用于因果推斷的分析方法，用于流行病學病因學領域[10]。MR分析利用單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）作為工具變量（instrumental variable，IV），并依靠減數分裂過程中均勻、隨機和獨立分布的遺傳變異，可以有效避免混雜因素和反向因果關系[11]。本研究基于大型全基因組關聯研究（genome-wide association studies，GWAS）匯總數據進行一項雙向兩樣本MR研究，探索不同血漿脂質體與主要NDD之間的因果關系，以期為臨床加強篩查及防范提供新的依據。
1 資料與方法
1.1 暴露與結局數據
本研究利用MR分析方法，以179種脂質體為暴露因素，AD、PD、ALS和SM在內的4種主要NDD為結局指標，研究脂質體與NDD疾病之間的因果關系。179種脂質體的GWAS數據來自一項涉及7 174名歐洲參與者的研究[12]，詳細數據可以從GWASCatalog網站下載獲取。179種脂質體屬于13個脂質類別，涵蓋4個主要脂質類別：甘油酯、甘油磷脂、鞘脂和甾醇。AD、PD和MS的GWAS數據來自FinnGen數據庫，ALS的GWAS數據庫來自IEU數據庫（表1）。
表1
本研究數據來源
1.2 IV選擇
在MR中IV需滿足3個假設[13]：與暴露密切相關（相關性假設）、獨立于研究中的潛在混雜因素（獨立性假設）及僅通過暴露與結局相關（排他性假設）。本研究對IV的選擇：① 以P<5×10?6，且連鎖不平衡參數為r2<0.001，kb=10 000為閾值條件[14]從脂質體中篩選符合條件的SNP；② 將篩選出來的SNP與NDD的數據進行合并，刪除兩者等位基因頻率不一致或者回文的SNP；③ 計算F統計量（設定F統計量>10時，SNP強度足夠）以驗證單個SNP的強度。為了避免弱工具偏差對因果推理的影響，我們使用了公式F=β2（暴露）/se2（暴露）計算IV的強度，并消除F<10的IV[15]。
1.3 統計分析
本研究采用雙向兩樣本MR分析，采用逆方差加權法（inverse variance weighting，IVW）進行分析，因為IVW在MR結局沒有多效性的情況下是效果最穩健和統計效能最佳的MR分析方法[16]。同時，以MR-Egger回歸、加權中位數法（weighted median estimator，WME）、加權眾數法（weighted mode，WM）、簡單眾數法（simple mode，SM）作為IVW的補充方法。本研究利用Cochran’s Q檢驗來評估IVW和MR-Egger中SNP的異質性，驗證MR結果的穩健性[17]。采用MR-Egger和MR-PRESSO來檢驗水平多效性，并利用留一法（leave-one-out）逐步剔除各SNP，計算并比較不同剩余SNP的合并效應，進行敏感性分析[18]。所有分析均采用R軟件（版本4.2.1）TwoSampleMR和MR-PRESSO軟件包進行[19]。
本研究利用MR-Steiger評估因果方向是否正確，暴露因素與結局之間是否存在反向因果，若P<0.05，則說明暴露與結局因果方向無誤；反之亦然。同時，在此基礎上以AD、PD、MS和ALS為暴露因素，相關脂質體為結局進行反向MR分析，對MR-Steiger結果進行驗證。
2 結果
2.1 IV選擇結果
本研究以179種脂質體作為暴露因素，多種NDD（包括AD、PD、ALS和MS）作為結局指標，在篩選IV的過程中，滿足相關參數條件，以確保所選SNP的合適性。MR結果中納入分析的每個SNP的F統計量均超過10，表明IV的穩健性，在結局中沒有發現弱偏倚IV，因此本研究的結論被認為是可靠的。陽性結果的SNP特征見附件表1～表4。
2.2 雙向兩樣本MR結果
2.2.1 脂質體與AD
正向MR分析一共鑒定出16種脂質體與AD之間存在因果關系（圖1）。MR Steiger方向性檢驗（附件表5）結果表明，10種脂質體與AD之間正相關趨勢一致。反向MR-IVW結果表明（附件表6），7種脂質體與AD之間存在反向因果關系。只有磷脂酰乙醇胺（PE）［OR=0.90，95%CI（0.83，0.99），P=0.03］、磷脂酰膽堿（PC）［OR=0.92，95%CI（0.85，0.99），P=0.02］和磷脂酰肌醇（PI）［OR=0.90，95%CI（0.83，0.99），P=0.03］三種脂質體與AD之間不存在反向因果。
圖1
阿爾茨海默病正向MR分析圖
兩樣本MR篩選出的SNP的F統計量范圍在20.93～491.51之間，表明SNP沒有弱IV，MR結果受弱IV偏倚影響的可能性小；Cochran’s Q統計量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局檢驗提示（表2），脂質體與AD之間的因果關系受異質性（P>0.05）和水平多效性（P>0.05）影響的可能性較小。漏斗圖結果顯示，符合篩選標準所納入的SNP大致數量相等地分布在IVW方法的兩側，所有SNP作為工具變量所得到的結果比較穩定，不受潛在因素影響而發生偏倚，見附件圖1。留一圖結果顯示，按順序刪除每個SNP會導致剩余的SNP位于無效線的同一側，這表明刪除任何SNP都不會對結果產生重大影響，見附件圖2。
表2
異質性和水平多效性檢驗
2.2.2 脂質體與PD
正向MR分析一共鑒定出4種脂質體與PD之間存在因果關系（圖2）。MR Steiger方向性檢驗（附件表5）結果表明，4種脂質體與PD之間正相關趨勢一致。反向MR-IVW結果表明（附件表6），4種脂質體與PD之間不存在反向因果關系。甾醇脂［OR=1.18，95%CI（1.04，1.34），P=0.01］、TG［OR=1.26，95%CI（1.02，1.56），P=0.03］、PE［OR=0.79，95%CI（0.64，0.98），P=0.03］和PC［OR=0.83，95%CI（0.69，0.98），P=0.03］四種脂質體與PD之間不存在反向因果。
圖2
帕金森病的正向MR分析圖
兩樣本MR篩選出的SNP的F統計量范圍在20.97～160.74之間，表明SNP沒有弱IV，MR結果受弱IV偏倚影響的可能性小；Cochran’s Q統計量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局檢驗提示（表2），MR結果沒有異質性和水平多效性，說明脂質體與PD之間的因果關系比較穩健。同時，漏斗圖（附件圖3）和留一圖結果顯示（附件圖4），MR結果比較穩定，不受潛在因素影響而發生偏倚，也不會因為刪除任何SNP會對結果產生重大影響。
2.2.3 脂質體與MS
正向MR分析發現8種脂質體與MS之間存在因果關系（圖3）。MR Steiger方向性檢驗（附件表5）結果表明，4種脂質體與MS之間正相關趨勢一致。反向MR-IVW結果表明（附件表6），4種脂質體與MS之間存在反向因果關系。只有DAG［OR=1.24，95%CI（1.01，1.54），P=0.04］、SM［OR=1.31，95%CI（1.08，1.58），P=0.01］、PI［OR=0.77，95%CI（0.62，0.95），P=0.02］和PC［OR=0.74，95%CI（0.58，0.95），P=0.02］，4種脂質體與MS之間不存在反向因果。
圖3
多發性硬化癥正向MR分析圖
兩樣本MR篩選出的SNP的F統計量范圍在20.88～173.64之間，表明SNP沒有弱IV，MR結果受弱IV偏倚影響的可能性小；Cochran’s Q統計量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局檢驗提示（表2），異質性和水平多效性不會對MR結果產生影響。漏斗圖（附件圖5）及留一圖（附件圖6）再次驗證了MR結果的穩健性，不受單一SNP和潛在因素的影響。
2.2.4 脂質體與ALS
正向MR分析一共鑒定出10種脂質體與ALS之間存在因果關系（圖4）。MR Steiger方向性檢驗（附件表5）結果表明，3種脂質體與ALS之間正相關趨勢一致。反向MR-IVW結果表明（附件表6），7種脂質體與ALS之間存在反向因果關系。只有TG［OR=1.03，95%CI（1.01，1.05），P=0.02］、PI［OR=0.98，95%CI（1.01，1.04），P=0.02］和PC［OR=0.77，95%CI（0.97，0.99），P=0.03］，3種脂質體與AD之間不存在反向因果。
圖4
肌萎縮側索硬化癥正向MR分析圖
兩樣本MR篩選出的SNP的F統計量范圍在20.94～505.91之間，表明SNP沒有弱IV，MR結果受弱IV偏倚影響的可能性小；Cochran’s Q統計量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局檢驗提示（表2），脂質體與ALS之間的因果關系受異質性（P>0.05）和水平多效性（P>0.05）影響的可能性較小。漏斗圖（附件圖7）及留一圖（附件圖8）顯示MR結果具有穩健性，不受單一SNP和潛在因素的影響。
3 討論
本研究通過利用公開的GWAS數據集進行兩樣本雙向MR分析，以此來探究179種脂質體與AD、PD、MS和ALS在內的多種NDD之間潛在的因果聯系。MR結果顯示，有一些脂質體可能與這些疾病存在因果聯系，對疾病的進展或預防起到一定作用。
蛋白質沉積是許多淀粉樣蛋白疾病的標志，包括AD和PD。PD與α-突觸核蛋白（α-Syn）的聚集有關[20]；在AD的情況下，淀粉樣蛋白β（Aβ）肽和過度磷酸化的tau蛋白的異常聚集被認為介導了大腦額葉皮層神經元的順序喪失[21]。PC是一種重要的脂質分子，廣泛存在于細胞膜中，特別是神經細胞膜。Dmitry等[22]研究表明PC可以改變淀粉樣蛋白的聚集率，抑制Aβ和α-Syn的聚集，并且可以降低淀粉樣蛋白低聚物形成的原纖維的毒性，減輕淀粉樣蛋白沉積對神經元的損傷，緩解AD和PD的病情進展，減輕AD和PD的發病風險。基底前腦的膽堿能神經元是早期AD發生病變所損傷的一種重要神經元，而PC對基底前腦灰質完整性發揮著重要作用[23]。PC可以預測基底前腦變性，并且可以通過減少炎癥和增加自噬清除機制來減輕AD模型中Aβ誘導的神經毒性，說明PC是AD的保護因素，提高PC水平可以減少AD的發病風險。AD的多種代謝途徑存在缺陷，近年來異常脂質代謝在AD中的作用逐漸被人們所重視。Batra等[24]研究發現，PC和PE的異常周轉構成了AD中最突出的腦代謝缺陷。P磁共振波譜研究顯示，AD患者的甘油磷酸膽堿（GPC）和甘油磷酸乙醇胺（GPE）濃度會升高[25,26]，而GPC和GPE伴隨著多種PC和PE分子物種的豐度降低，說明AD患者中的PC和PE在加速代謝和分解，因此提高PC和PE的濃度可能會對AD的預防和治療起到一定的保護作用。相關研究表明，AD的病理機制和神經元炎癥和氧化應激也密切相關。PI是體內一類重要的磷脂，并且可以轉化為多種衍生物，例如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）等。PI可以增加抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶等）的表達和活性，也可以與NADPH氧化酶亞基（p47phox）結合，抑制NADPH氧化酶的活性，從而減少活性氧的產生，從而有效清除自由基和氧化物質，降低氧化應激水平，減輕氧化應激對細胞的傷害[27]。磷脂酰肌醇通過抑制炎癥相關的信號通路，如核因子κB（NF-κB）信號通路，降低炎癥因子的表達水平，減少炎癥反應的強度。此外，磷脂酰肌醇還能夠調節炎癥細胞的遷移和調控白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥促進因子的合成，進一步發揮抗炎作用[28]。這些抗炎和抗氧化的作用有助于保護神經元免受損害，減緩AD的進展。
PD的病理特征包括黑質中多巴胺能神經元進行性死亡和路易體的形成，這與神經元中α-Syn異常聚集密切相關。相關研究表明，膽固醇在腦中的過度累積不僅會阻礙突觸可塑性，還會引發細胞凋亡致神經元死亡，促進PD等退行性疾病的發展[29]。高水平的腦膽固醇似乎是帕金森病發展的重要因素。Raju等[30]發現外源性膽固醇在暴露于1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）（一種帕金森神經毒素）后，通過增加線粒體膜電位的去極化，加速多巴胺能神經元的死亡。Galvagnion等[31]研究發現，主要存在于突觸前末端的α-Syn可以與特定的脂質家族（如鞘脂、脂肪酸和甾醇）結合并形成α螺旋脂質-蛋白質復合物。這些復合物會增加α-突觸核蛋白形成不溶性細胞內斑塊的傾向，從而引起神經元損傷，甾醇脂作為甾醇的一種，也具有這樣的功能，可以增加PD的發病風險。相關研究表明，PE對線蟲α-Syn誘導的多巴胺能神經元變性有顯著保護作用[32]。一項影像學研究發現，與健康對照組相比，PD患者中腦和腦脊液中的磷酸乙醇胺水平顯著降低，說明提高PE水平可能對PD患者有治療作用[33]。
MS以神經炎癥和神經退行性變為特征，Seyed等[34]對MS患者的血漿樣本進行分析，結果顯示DAG的水平顯著增高，說明MS患者體內DAG含量異常增長，DAG可能增加MS的發病風險。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）大鼠是MS的最佳動物模型，Cui等[35]在動物實驗中發現，大鼠EAE誘導早期DAG的積累，也說明DAG升高與MS的發病密切相關。Silke等[36]通過EAE大鼠動物實驗發現，如果用阿米替林，即鞘磷脂水解酶的功能抑制劑治療小鼠，可以防止EAE的發展，并顯著減弱特征性的有害神經炎癥反應，說明高水平的鞘磷脂被水解后會產生神經炎癥，損傷神經元，最終可能導致MS，是MS的危險因素。神經血管單位（NVU）由神經元、神經膠質細胞和血管細胞組成，確保血腦屏障（BBB）的正確穩態，并間接確保中樞神經系統的功能。PC可以調節NVU細胞的生理功能，起到保護作用，防止NVU的損傷。同時，如果PC缺乏，會導致包括MS在內的多種神經退行性疾病的發展[37]。PI是細胞膜磷脂的一種，在體內的作用主要通過其磷酸化產物如磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）和磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3）發揮作用，同時PI也是磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）的底物。PIP3是Akt激酶的活化子，是PI通過PI3K信號通路生成的。小膠質細胞是中樞神經系統的主要免疫細胞，負責MS的病理性炎癥脫髓鞘。相關研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號通路介導的小膠質細胞自噬激活，可以抑制小膠質細胞的炎癥反應，減輕EAE的癥狀[38]。
ALS是一組以運動神經元損傷和各種肌肉功能喪失為特征的異質性進行性神經退行性疾病，血脂異常在ALS常見。一項隊列研究表明，經過長期的隨訪，較高水平的TG與ALS發病風險增加有關[39]。Katherine等[40]對ALS患者血清的脂質組學進行分析，發現與健康組相比，TG的富集程度顯著升高，并且隨著ALS疾病的進展，容易發生脂質過氧化，增加有毒脂質產物的形成。Wagey等[41]研究發現，與健康對照組相比，死于ALS的患者脊髓組織顆粒部分中PI3K的活性和蛋白水平升高。相關研究表明，VAPB/ALS8蛋白突變可引起ALS，通過減少與VAPB相關的PI4P增加，可以減緩多種ALS中的運動神經元缺陷、神經退行性變或神經突延伸減少[42]。Arima等[43]通過動物實驗，分析ALS小鼠模型發現，ALS小鼠脊髓中PC水平顯著降低，反映了運動神經元的損害與喪失。ALS中存在Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD）的基因突變，Ikeda等[44]發現，對ALS小鼠注射PC結合的Cu/ZnSOD減緩了運動功能障礙的進展，防止了去神經支配肌肉萎縮，并延緩了小鼠脊髓運動神經元的退化，其作用機制與氧化應激有關。
由于全球人口老齡化導致NDD發病率和死亡率不斷升高，近年來對于NDD的治療一直是醫療領域的熱點問題。BBB作為血液和腦組織之間的動態界面，選擇性地限制包括治療劑在內的物質通過，這導致病變區域的藥物濃度較低，對有效治療腦部疾病提出了挑戰。相關研究表明，用各種配體修飾的脂質體在穿透血腦屏障和靶向不同疾病相關的病變方面表現出顯著優勢[45,46]。配體修飾的脂質體作為載體遞送在治療多種NDD中發揮著至關重要的作用，如阿爾茨海默病、帕金森病等[47]。本研究的雙向MR結果顯示，一些脂質體可以作為NDD治療的載體，將治療藥物封裝在其中，不僅可以提高藥物濃度，而且能夠穿越BBB的阻礙，并最終實現對疾病的有效治療[48]。當然對于NDD來說，由于發病機制尚不明確，病變區域的結構和功能復雜，脂質體遞送系統在實現靶向大腦方面面臨挑戰，需要更深入的研究[49]。
本研究的優點是通過雙向兩樣本MR分析來研究179種脂質體與多種NDD之間的因果關系，這是對脂質體與NDD之間相關性的最全面的研究。MR分析利用SNP作為IV來推斷因果關系，可以有效克服反向因果關系和混雜引起的偏差。同時，為了保證MR分析的準確性，我們進行了敏感性檢驗。我們選取的暴露因素和結局的數據來源于不同國家的歐洲人群，以避免不必要的偏倚。當然，這項研究的局限性也不容忽視。首先，盡管我們采取了控制措施，但工具變量可能仍然具有無法衡量的混淆并影響結果。其次，MR建立在暴露與結局間線性關系成立的假設下，不討論一切非線性關系，故不普遍適用；同時，由于缺乏按年齡和性別分類的匯總級數據，本研究無法基于這些因素對不同NDD進行分層分析；最后，本研究僅納入了歐洲血統的人群，可能會限制研究結果在其他族裔人群中的應用。
綜上所述，本研究對179種和多種NDD之間進行了雙向MR分析，結果顯示甾醇酯、膽固醇、PC、PE、PI、DAG、SM、TG和不同的NDD之間存在因果聯系，然而該結果還需要進一步的實驗驗證，并在此基礎上開展深入的分子機制挖掘，為NDD的早期篩查與可能的藥物靶點提供基礎。
隨著醫療水平的進步和衛生服務的提高，全球人均預期壽命不斷提高，老年人口不斷增加，實現健康老齡化是一個巨大挑戰[1]。神經系統疾病在所有年齡段死亡人數中占比最高，也是造成過去十年非傳染性疾病中老年人死亡百分比變化最大的原因[2]。神經退行性疾病（neurodegenerative diseases，NDD）的特征是神經元之間的連接和通信中斷以及中樞或周圍神經系統的進行性功能喪失，導致運動和認知過程受損。NDD的主要類型包括阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）、肌萎縮側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和多發性硬化癥（multiple sclerosis，MS）。遺傳易感性是這些具有離散形態學和病理生理學特征的NDD發生的主要危險因素之一，說明退行性病變和遺傳因素有關[3]。目前NDD的治療僅限于對癥治療，迫切需要能夠阻止或減緩潛在神經退行性過程的治療方法。
脂質在體內分布廣泛，占細胞膜重量的50%，是血液代謝產物的重要組成部分[4]。脂質通常是疏水分子和組織的重要組成部分，在多種生物過程中發揮重要作用，比如信號傳導、能量代謝、免疫反應等[5]。脂質代謝與機體的生理、病理密切相關，并且在基因組到表型組的遺傳信息流動中，脂質組比轉錄組或蛋白質組更接近表型組。因此，脂質組學可以更好地為研究遺傳相關的NDD提供基因層面上的信息和見解[6]。脂質代謝紊亂引起的各種特異性蛋白聚集和沉積是NDD發病的重要危險因素，并且長期影響NDD的發病、進展和嚴重程度[7]。對NDD患者和動物模型的脂質組學分析也揭示了多種脂質水平的改變，包括膽固醇、甘油磷脂、鞘脂等[8,9]。為了進一步了解脂質和NDD之間的相互作用，并提出早期治療策略以改善和緩解相關疾病人群癥狀，有必要明確血漿脂質與NDD之間的潛在因果關系。但是由于觀察性研究存在混雜因素、反向因果、測量誤差等局限性，無法提供因果聯系的直接證據。
孟德爾隨機化（Mendelian randomization，MR）分析是一種用于因果推斷的分析方法，用于流行病學病因學領域[10]。MR分析利用單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）作為工具變量（instrumental variable，IV），并依靠減數分裂過程中均勻、隨機和獨立分布的遺傳變異，可以有效避免混雜因素和反向因果關系[11]。本研究基于大型全基因組關聯研究（genome-wide association studies，GWAS）匯總數據進行一項雙向兩樣本MR研究，探索不同血漿脂質體與主要NDD之間的因果關系，以期為臨床加強篩查及防范提供新的依據。
1 資料與方法
1.1 暴露與結局數據
本研究利用MR分析方法，以179種脂質體為暴露因素，AD、PD、ALS和SM在內的4種主要NDD為結局指標，研究脂質體與NDD疾病之間的因果關系。179種脂質體的GWAS數據來自一項涉及7 174名歐洲參與者的研究[12]，詳細數據可以從GWASCatalog網站下載獲取。179種脂質體屬于13個脂質類別，涵蓋4個主要脂質類別：甘油酯、甘油磷脂、鞘脂和甾醇。AD、PD和MS的GWAS數據來自FinnGen數據庫，ALS的GWAS數據庫來自IEU數據庫（表1）。
表1
本研究數據來源
1.2 IV選擇
在MR中IV需滿足3個假設[13]：與暴露密切相關（相關性假設）、獨立于研究中的潛在混雜因素（獨立性假設）及僅通過暴露與結局相關（排他性假設）。本研究對IV的選擇：① 以P<5×10?6，且連鎖不平衡參數為r2<0.001，kb=10 000為閾值條件[14]從脂質體中篩選符合條件的SNP；② 將篩選出來的SNP與NDD的數據進行合并，刪除兩者等位基因頻率不一致或者回文的SNP；③ 計算F統計量（設定F統計量>10時，SNP強度足夠）以驗證單個SNP的強度。為了避免弱工具偏差對因果推理的影響，我們使用了公式F=β2（暴露）/se2（暴露）計算IV的強度，并消除F<10的IV[15]。
1.3 統計分析
本研究采用雙向兩樣本MR分析，采用逆方差加權法（inverse variance weighting，IVW）進行分析，因為IVW在MR結局沒有多效性的情況下是效果最穩健和統計效能最佳的MR分析方法[16]。同時，以MR-Egger回歸、加權中位數法（weighted median estimator，WME）、加權眾數法（weighted mode，WM）、簡單眾數法（simple mode，SM）作為IVW的補充方法。本研究利用Cochran’s Q檢驗來評估IVW和MR-Egger中SNP的異質性，驗證MR結果的穩健性[17]。采用MR-Egger和MR-PRESSO來檢驗水平多效性，并利用留一法（leave-one-out）逐步剔除各SNP，計算并比較不同剩余SNP的合并效應，進行敏感性分析[18]。所有分析均采用R軟件（版本4.2.1）TwoSampleMR和MR-PRESSO軟件包進行[19]。
本研究利用MR-Steiger評估因果方向是否正確，暴露因素與結局之間是否存在反向因果，若P<0.05，則說明暴露與結局因果方向無誤；反之亦然。同時，在此基礎上以AD、PD、MS和ALS為暴露因素，相關脂質體為結局進行反向MR分析，對MR-Steiger結果進行驗證。
2 結果
2.1 IV選擇結果
本研究以179種脂質體作為暴露因素，多種NDD（包括AD、PD、ALS和MS）作為結局指標，在篩選IV的過程中，滿足相關參數條件，以確保所選SNP的合適性。MR結果中納入分析的每個SNP的F統計量均超過10，表明IV的穩健性，在結局中沒有發現弱偏倚IV，因此本研究的結論被認為是可靠的。陽性結果的SNP特征見附件表1～表4。
2.2 雙向兩樣本MR結果
2.2.1 脂質體與AD
正向MR分析一共鑒定出16種脂質體與AD之間存在因果關系（圖1）。MR Steiger方向性檢驗（附件表5）結果表明，10種脂質體與AD之間正相關趨勢一致。反向MR-IVW結果表明（附件表6），7種脂質體與AD之間存在反向因果關系。只有磷脂酰乙醇胺（PE）［OR=0.90，95%CI（0.83，0.99），P=0.03］、磷脂酰膽堿（PC）［OR=0.92，95%CI（0.85，0.99），P=0.02］和磷脂酰肌醇（PI）［OR=0.90，95%CI（0.83，0.99），P=0.03］三種脂質體與AD之間不存在反向因果。
圖1
阿爾茨海默病正向MR分析圖
兩樣本MR篩選出的SNP的F統計量范圍在20.93～491.51之間，表明SNP沒有弱IV，MR結果受弱IV偏倚影響的可能性小；Cochran’s Q統計量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局檢驗提示（表2），脂質體與AD之間的因果關系受異質性（P>0.05）和水平多效性（P>0.05）影響的可能性較小。漏斗圖結果顯示，符合篩選標準所納入的SNP大致數量相等地分布在IVW方法的兩側，所有SNP作為工具變量所得到的結果比較穩定，不受潛在因素影響而發生偏倚，見附件圖1。留一圖結果顯示，按順序刪除每個SNP會導致剩余的SNP位于無效線的同一側，這表明刪除任何SNP都不會對結果產生重大影響，見附件圖2。
表2
異質性和水平多效性檢驗
2.2.2 脂質體與PD
正向MR分析一共鑒定出4種脂質體與PD之間存在因果關系（圖2）。MR Steiger方向性檢驗（附件表5）結果表明，4種脂質體與PD之間正相關趨勢一致。反向MR-IVW結果表明（附件表6），4種脂質體與PD之間不存在反向因果關系。甾醇脂［OR=1.18，95%CI（1.04，1.34），P=0.01］、TG［OR=1.26，95%CI（1.02，1.56），P=0.03］、PE［OR=0.79，95%CI（0.64，0.98），P=0.03］和PC［OR=0.83，95%CI（0.69，0.98），P=0.03］四種脂質體與PD之間不存在反向因果。
圖2
帕金森病的正向MR分析圖
兩樣本MR篩選出的SNP的F統計量范圍在20.97～160.74之間，表明SNP沒有弱IV，MR結果受弱IV偏倚影響的可能性小；Cochran’s Q統計量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局檢驗提示（表2），MR結果沒有異質性和水平多效性，說明脂質體與PD之間的因果關系比較穩健。同時，漏斗圖（附件圖3）和留一圖結果顯示（附件圖4），MR結果比較穩定，不受潛在因素影響而發生偏倚，也不會因為刪除任何SNP會對結果產生重大影響。
2.2.3 脂質體與MS
正向MR分析發現8種脂質體與MS之間存在因果關系（圖3）。MR Steiger方向性檢驗（附件表5）結果表明，4種脂質體與MS之間正相關趨勢一致。反向MR-IVW結果表明（附件表6），4種脂質體與MS之間存在反向因果關系。只有DAG［OR=1.24，95%CI（1.01，1.54），P=0.04］、SM［OR=1.31，95%CI（1.08，1.58），P=0.01］、PI［OR=0.77，95%CI（0.62，0.95），P=0.02］和PC［OR=0.74，95%CI（0.58，0.95），P=0.02］，4種脂質體與MS之間不存在反向因果。
圖3
多發性硬化癥正向MR分析圖
兩樣本MR篩選出的SNP的F統計量范圍在20.88～173.64之間，表明SNP沒有弱IV，MR結果受弱IV偏倚影響的可能性小；Cochran’s Q統計量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局檢驗提示（表2），異質性和水平多效性不會對MR結果產生影響。漏斗圖（附件圖5）及留一圖（附件圖6）再次驗證了MR結果的穩健性，不受單一SNP和潛在因素的影響。
2.2.4 脂質體與ALS
正向MR分析一共鑒定出10種脂質體與ALS之間存在因果關系（圖4）。MR Steiger方向性檢驗（附件表5）結果表明，3種脂質體與ALS之間正相關趨勢一致。反向MR-IVW結果表明（附件表6），7種脂質體與ALS之間存在反向因果關系。只有TG［OR=1.03，95%CI（1.01，1.05），P=0.02］、PI［OR=0.98，95%CI（1.01，1.04），P=0.02］和PC［OR=0.77，95%CI（0.97，0.99），P=0.03］，3種脂質體與AD之間不存在反向因果。
圖4
肌萎縮側索硬化癥正向MR分析圖
兩樣本MR篩選出的SNP的F統計量范圍在20.94～505.91之間，表明SNP沒有弱IV，MR結果受弱IV偏倚影響的可能性小；Cochran’s Q統計量、MR-Egger截距和MR-PRESSO全局檢驗提示（表2），脂質體與ALS之間的因果關系受異質性（P>0.05）和水平多效性（P>0.05）影響的可能性較小。漏斗圖（附件圖7）及留一圖（附件圖8）顯示MR結果具有穩健性，不受單一SNP和潛在因素的影響。
3 討論
本研究通過利用公開的GWAS數據集進行兩樣本雙向MR分析，以此來探究179種脂質體與AD、PD、MS和ALS在內的多種NDD之間潛在的因果聯系。MR結果顯示，有一些脂質體可能與這些疾病存在因果聯系，對疾病的進展或預防起到一定作用。
蛋白質沉積是許多淀粉樣蛋白疾病的標志，包括AD和PD。PD與α-突觸核蛋白（α-Syn）的聚集有關[20]；在AD的情況下，淀粉樣蛋白β（Aβ）肽和過度磷酸化的tau蛋白的異常聚集被認為介導了大腦額葉皮層神經元的順序喪失[21]。PC是一種重要的脂質分子，廣泛存在于細胞膜中，特別是神經細胞膜。Dmitry等[22]研究表明PC可以改變淀粉樣蛋白的聚集率，抑制Aβ和α-Syn的聚集，并且可以降低淀粉樣蛋白低聚物形成的原纖維的毒性，減輕淀粉樣蛋白沉積對神經元的損傷，緩解AD和PD的病情進展，減輕AD和PD的發病風險。基底前腦的膽堿能神經元是早期AD發生病變所損傷的一種重要神經元，而PC對基底前腦灰質完整性發揮著重要作用[23]。PC可以預測基底前腦變性，并且可以通過減少炎癥和增加自噬清除機制來減輕AD模型中Aβ誘導的神經毒性，說明PC是AD的保護因素，提高PC水平可以減少AD的發病風險。AD的多種代謝途徑存在缺陷，近年來異常脂質代謝在AD中的作用逐漸被人們所重視。Batra等[24]研究發現，PC和PE的異常周轉構成了AD中最突出的腦代謝缺陷。P磁共振波譜研究顯示，AD患者的甘油磷酸膽堿（GPC）和甘油磷酸乙醇胺（GPE）濃度會升高[25,26]，而GPC和GPE伴隨著多種PC和PE分子物種的豐度降低，說明AD患者中的PC和PE在加速代謝和分解，因此提高PC和PE的濃度可能會對AD的預防和治療起到一定的保護作用。相關研究表明，AD的病理機制和神經元炎癥和氧化應激也密切相關。PI是體內一類重要的磷脂，并且可以轉化為多種衍生物，例如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）等。PI可以增加抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶等）的表達和活性，也可以與NADPH氧化酶亞基（p47phox）結合，抑制NADPH氧化酶的活性，從而減少活性氧的產生，從而有效清除自由基和氧化物質，降低氧化應激水平，減輕氧化應激對細胞的傷害[27]。磷脂酰肌醇通過抑制炎癥相關的信號通路，如核因子κB（NF-κB）信號通路，降低炎癥因子的表達水平，減少炎癥反應的強度。此外，磷脂酰肌醇還能夠調節炎癥細胞的遷移和調控白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥促進因子的合成，進一步發揮抗炎作用[28]。這些抗炎和抗氧化的作用有助于保護神經元免受損害，減緩AD的進展。
PD的病理特征包括黑質中多巴胺能神經元進行性死亡和路易體的形成，這與神經元中α-Syn異常聚集密切相關。相關研究表明，膽固醇在腦中的過度累積不僅會阻礙突觸可塑性，還會引發細胞凋亡致神經元死亡，促進PD等退行性疾病的發展[29]。高水平的腦膽固醇似乎是帕金森病發展的重要因素。Raju等[30]發現外源性膽固醇在暴露于1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）（一種帕金森神經毒素）后，通過增加線粒體膜電位的去極化，加速多巴胺能神經元的死亡。Galvagnion等[31]研究發現，主要存在于突觸前末端的α-Syn可以與特定的脂質家族（如鞘脂、脂肪酸和甾醇）結合并形成α螺旋脂質-蛋白質復合物。這些復合物會增加α-突觸核蛋白形成不溶性細胞內斑塊的傾向，從而引起神經元損傷，甾醇脂作為甾醇的一種，也具有這樣的功能，可以增加PD的發病風險。相關研究表明，PE對線蟲α-Syn誘導的多巴胺能神經元變性有顯著保護作用[32]。一項影像學研究發現，與健康對照組相比，PD患者中腦和腦脊液中的磷酸乙醇胺水平顯著降低，說明提高PE水平可能對PD患者有治療作用[33]。
MS以神經炎癥和神經退行性變為特征，Seyed等[34]對MS患者的血漿樣本進行分析，結果顯示DAG的水平顯著增高，說明MS患者體內DAG含量異常增長，DAG可能增加MS的發病風險。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）大鼠是MS的最佳動物模型，Cui等[35]在動物實驗中發現，大鼠EAE誘導早期DAG的積累，也說明DAG升高與MS的發病密切相關。Silke等[36]通過EAE大鼠動物實驗發現，如果用阿米替林，即鞘磷脂水解酶的功能抑制劑治療小鼠，可以防止EAE的發展，并顯著減弱特征性的有害神經炎癥反應，說明高水平的鞘磷脂被水解后會產生神經炎癥，損傷神經元，最終可能導致MS，是MS的危險因素。神經血管單位（NVU）由神經元、神經膠質細胞和血管細胞組成，確保血腦屏障（BBB）的正確穩態，并間接確保中樞神經系統的功能。PC可以調節NVU細胞的生理功能，起到保護作用，防止NVU的損傷。同時，如果PC缺乏，會導致包括MS在內的多種神經退行性疾病的發展[37]。PI是細胞膜磷脂的一種，在體內的作用主要通過其磷酸化產物如磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）和磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3）發揮作用，同時PI也是磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）的底物。PIP3是Akt激酶的活化子，是PI通過PI3K信號通路生成的。小膠質細胞是中樞神經系統的主要免疫細胞，負責MS的病理性炎癥脫髓鞘。相關研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號通路介導的小膠質細胞自噬激活，可以抑制小膠質細胞的炎癥反應，減輕EAE的癥狀[38]。
ALS是一組以運動神經元損傷和各種肌肉功能喪失為特征的異質性進行性神經退行性疾病，血脂異常在ALS常見。一項隊列研究表明，經過長期的隨訪，較高水平的TG與ALS發病風險增加有關[39]。Katherine等[40]對ALS患者血清的脂質組學進行分析，發現與健康組相比，TG的富集程度顯著升高，并且隨著ALS疾病的進展，容易發生脂質過氧化，增加有毒脂質產物的形成。Wagey等[41]研究發現，與健康對照組相比，死于ALS的患者脊髓組織顆粒部分中PI3K的活性和蛋白水平升高。相關研究表明，VAPB/ALS8蛋白突變可引起ALS，通過減少與VAPB相關的PI4P增加，可以減緩多種ALS中的運動神經元缺陷、神經退行性變或神經突延伸減少[42]。Arima等[43]通過動物實驗，分析ALS小鼠模型發現，ALS小鼠脊髓中PC水平顯著降低，反映了運動神經元的損害與喪失。ALS中存在Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD）的基因突變，Ikeda等[44]發現，對ALS小鼠注射PC結合的Cu/ZnSOD減緩了運動功能障礙的進展，防止了去神經支配肌肉萎縮，并延緩了小鼠脊髓運動神經元的退化，其作用機制與氧化應激有關。
由于全球人口老齡化導致NDD發病率和死亡率不斷升高，近年來對于NDD的治療一直是醫療領域的熱點問題。BBB作為血液和腦組織之間的動態界面，選擇性地限制包括治療劑在內的物質通過，這導致病變區域的藥物濃度較低，對有效治療腦部疾病提出了挑戰。相關研究表明，用各種配體修飾的脂質體在穿透血腦屏障和靶向不同疾病相關的病變方面表現出顯著優勢[45,46]。配體修飾的脂質體作為載體遞送在治療多種NDD中發揮著至關重要的作用，如阿爾茨海默病、帕金森病等[47]。本研究的雙向MR結果顯示，一些脂質體可以作為NDD治療的載體，將治療藥物封裝在其中，不僅可以提高藥物濃度，而且能夠穿越BBB的阻礙，并最終實現對疾病的有效治療[48]。當然對于NDD來說，由于發病機制尚不明確，病變區域的結構和功能復雜，脂質體遞送系統在實現靶向大腦方面面臨挑戰，需要更深入的研究[49]。
本研究的優點是通過雙向兩樣本MR分析來研究179種脂質體與多種NDD之間的因果關系，這是對脂質體與NDD之間相關性的最全面的研究。MR分析利用SNP作為IV來推斷因果關系，可以有效克服反向因果關系和混雜引起的偏差。同時，為了保證MR分析的準確性，我們進行了敏感性檢驗。我們選取的暴露因素和結局的數據來源于不同國家的歐洲人群，以避免不必要的偏倚。當然，這項研究的局限性也不容忽視。首先，盡管我們采取了控制措施，但工具變量可能仍然具有無法衡量的混淆并影響結果。其次，MR建立在暴露與結局間線性關系成立的假設下，不討論一切非線性關系，故不普遍適用；同時，由于缺乏按年齡和性別分類的匯總級數據，本研究無法基于這些因素對不同NDD進行分層分析；最后，本研究僅納入了歐洲血統的人群，可能會限制研究結果在其他族裔人群中的應用。
綜上所述，本研究對179種和多種NDD之間進行了雙向MR分析，結果顯示甾醇酯、膽固醇、PC、PE、PI、DAG、SM、TG和不同的NDD之間存在因果聯系，然而該結果還需要進一步的實驗驗證，并在此基礎上開展深入的分子機制挖掘，為NDD的早期篩查與可能的藥物靶點提供基礎。
